sensory epithelia of human vestibule

Kong Weijia, Burkhard Hussl, Anneliese Schrott-Fischer

【摘要】 目的 探讨胆碱能神经在人体前庭终器的神经支配。方法 以乙酰胆碱(Ach)的合成酶胆碱乙酰基转移酶(choline acetyltransferase, ChAT)为标记物,应用包埋前染色免疫细胞化学方法,透射电镜观察5例尸头双侧前庭感觉上皮中ChAT的分布。结果人体前庭终器感觉上皮层内富含突触小泡的神经末梢和神经纤维呈现ChAT染色反应阳性,它们与包绕Ⅰ型前庭毛细胞的传入神经盏形成轴-树突触,并直接与Ⅱ型前庭毛细胞胞体形成轴-体突触。结论 ChAT定位于前庭传出神经系统,人体前庭Ⅰ型和Ⅱ型毛细胞都受胆碱能传出神经支配。

Imunocytochemical study of cholinergic innervation in the neurosensory epithelia of human vestibule Kong Weijia^*, Burkhard Hussl, anneliese Schrott-Fischer.^*Union Hospital of Tongji Medical University, Wuhan 430022

【Abstract】 Objective To investigate the cholinergic innervation of the neurosensory epitheliaof human vestibule.Methods A modified preembedding immunostaining technique for immunoelectron-microscopy was applied to this study. A polyclonal antibody to choline acetyltransferase (ChAT) wasused as the marker of cholinergic fibers.Results ChAT-immunoreactive products were restricted

to the nerve fibers and terminals which were rich in synaptic vesicles. The ChAT-immunoreactive fibers synaps with afferent chalice as well as with type Ⅱ sensory hair cells.Conclusion This study demonstrates that cholinergic fibers innervate the neurosensory epithelia of human vestible. The cholinergic fibers of human vestibular sensory epithelia blong to the vestibular efferent system.

【Key words】 vestibule Vestibular nerve Neurons efferent Choline acetyltransferase

人和脊椎动物前庭终器都接受起自脑干的传出神经系统支配。前庭传出神经系统的神经递质及其作用是耳科领域的研究热点之一。组织化学实验结果显示,动物前庭感觉上皮呈乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)的降解酶——乙酰胆碱脂酶(acetylcholin esterase,AchE)染色阳性。但是AchE的定位既不能有助于鉴别神经突触前后成分,又有可能出现于数种单胺类神经元以及非神经元结构中。故AchE并非胆碱能神经的特异性标记酶。Ach的合成酶——胆碱乙酰基转移酶(choline acetyltransferase, ChAT)被认为是胆碱能神经的特异性标记酶。1994年我们^［1］报道了ChAT在大鼠前庭终器的超微定位。本研究以ChAT为标记酶,探讨人体前庭感觉上皮胆碱能神经的超微定位。

材料与方法

一、实验材料

内耳供体为5例死于头颈恶性肿瘤,生前无中耳和内耳疾患的患者(全部为男性,年龄53～70岁)。于患者死亡后2小时内用4％多聚甲醛和0.1％戊二醛磷酸缓冲液(pH7.4)作原位内耳灌注固定^［2］。在尸检室取出双侧颞骨后,在相同固定液中进一步浸泡固定18～20小时。颞骨置0.1 mol／L磷酸缓冲液(PBS,pH7.4)中漂洗后,在解剖显微镜下解剖分离出前庭囊斑及壶腹嵴,供免疫细胞化学染色。

二、抗ChAT抗体免疫细胞化学染色

采用间接法包埋前免疫细胞化学染色。主要步骤如下:将前庭终器标本置于①30％羊血清、1％小牛血清白蛋白室温封闭30分钟；②兔抗ChAT抗体(1∶250,美国Chemicon International公司)4℃孵育24小时；③辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶100,法国Biosys公司)室温孵育2小时；④DAB过氧化氢氯化钴增强显色。上述各步骤之间用PBS漂洗3次每次10分钟。

在各次重复实验中,用5只大鼠双侧前庭终器标本用作阳性对照染色,用正常兔血清取代兔抗ChAT抗体作为阴性对照染色。

三、标本包埋及观察

将经免疫细胞化学染色处理的标本按常规方法行梯度酒精脱水、Spurr树脂塑料包埋。Reichert-Jung切片机上行半薄切片，光镜下观察定位；超薄切片标本在Jeol100-C透射电镜下观察。

结 果

在透射电镜下观察发现,人体前庭终器感觉上皮层内有大量的ChAT免疫染色阳性神经分布。ChAT染色阳性的神经末梢主要与包绕Ⅰ型前庭毛细胞的传入神经盏形成轴-树突触联系(图1),并直接与Ⅱ型前庭毛细胞胞体形成轴-体突触联系(图2)。而Ⅰ型及Ⅱ型前庭毛细胞ChAT免疫染色阴性反应,包绕Ⅰ型毛细胞的传入神经盏以及其它传入神经纤维亦呈阴性染色。ChAT免疫染色在人体前庭囊斑和半规管壶腹嵴感觉上皮内的定位相同,但本研究未对其分布密度作定量分析。在高倍电镜下观察,见ChAT免疫染色阳性反应者为富含突触小泡的传出神经纤维和神经末梢(图3,4)。部分与传入神经盏形成轴-树突触，并富含突触小泡的神经末梢呈ChAT染色阴性反应。

在各组免疫细胞化学染色实验中,作阳性对照染色的大鼠前庭终器标本的ChAT染色类型与我们^［1］以前的报道一致,ChAT阳性反应者为富含突触小泡的传出神经纤维。而阴性对照染色标本全部未显染色。

讨 论

前庭毛细胞接受传入和传出两种神经系统支配。Ⅰ型前庭毛细胞被传入神经盏包绕,而Ⅱ型前庭毛细胞与呈钮扣状膨大的传入神经末梢形成突触联系。传出神经末梢则与包绕Ⅰ型前庭毛细胞的传入神经盏形成轴-树突触以支配Ⅰ型前庭毛细胞,并直接与Ⅱ型前庭毛细胞胞体形成轴-体突触。我们的研究揭示了ChAT在人体前庭感觉上皮的超微定位，发现ChAT染色阳性反应定位于前庭传出神经系统。ChAT阳性传出神经纤维对前庭Ⅰ型和Ⅱ型毛细胞都有神经支配。

本实验尚观察到,某些与包绕Ⅰ型毛细胞的神经盏形成轴-树突触并富含突触小泡的传出神经末梢呈ChAT免疫染色阴性反应。该种非ChAT传出神经的神经递质种类尚不清楚。动物实验结果表明,哺乳动物前庭传出神经系统含有数种神经递质或神经调制物。我们^［1，3］的研究发现,胆碱能前庭传出神经支配大鼠前庭Ⅰ型和Ⅱ型毛细胞 ,γ-氨基丁酸(gama-aminobutyric acid, GABA)能前庭传出神经也支配大鼠前庭Ⅰ型毛细胞 。此外,Tanaka等^［4］报道,降钙素基因相关肽(calcitoningene-related peptide, CGRP)阳性前庭传出神经末梢支配大鼠前庭Ⅰ型毛细胞。Wackym^［5］观察发现,大鼠前庭Ⅱ型毛细胞也有少量CGRP阳性传出神经支配。我们^［6］的研究结果发现CGRP阳性传出神经对大鼠前庭Ⅰ型和Ⅱ型毛细胞有较复杂的支配类型。本研究所观察到的非ChAT传出神经推测可能为GABA或CGRP阳性神经纤维。结果提示:人体前庭终器至少接受两种传出神经系统支配。

前庭传出神经系统的功能意义至今尚未阐明。动物实验结果显示,前庭传出神经系统对前庭传入神经系统有兴奋和抑制两种不同的影响。Rossi等^［7］报道,电刺激前庭传出神经可减少蛙的大部分前庭传入神经的电活动,仅少部分传入神经表现为电活动增加。Goldberg等^［8］实验观察到,电刺激鼠猴前庭传出神经可增加多数前庭传入神经的自发性电活动排放率,仅对不到1％的前庭传入神经自发性电活动呈抑制性效应。然而,当传入神经因受刺激而表现兴奋性或抑制性反应时,刺激传出神经可减少传入神经受刺激反应的增益。迄今,前庭胆碱能传出神经对前庭传入神经的作用及机理皆不清楚。本实验结果揭示:人体前庭终器接受胆碱能传出神经的支配。人体前庭胆碱能传出神经的生理作用及病理意义尚有待进一步探讨。

图1 人体前庭球囊斑感觉上皮抗 chAT 抗体染色免疫电镜照片。呈ChAT染色阳性的神经末梢(↑)与包绕Ⅰ型毛细胞(Ⅰ) 的传入神经盏(Ch)形成突触联系。×3200

图2 人体前庭球囊斑感觉上皮抗 ChAT抗体染色免疫电镜照片。呈ChAT染色阳性的神经末梢(↑)与Ⅱ型毛细胞(Ⅱ)形成突触。×3200

图3 为图1局部之高倍电镜照片。呈ChAT染色阳性的神经末梢内充满突触小泡。×16000

图4 为图2局部的高倍电镜照片。呈ChAT 染色阳性的神经末梢(↑)内充满突触小泡。×16000

参考文献

1Kong WJ, Egg G, Hussl B, et al. Localization of Chat-like immunoreativity in the vestibularendorgans of the rat. Hear Res, 1994,75:191-200.

2Kong WJ,Egg G, Hussl B, et al. A study of neurotransmitters in human inner ear:

preservation of human temporal bone and value of organ donation for inner ear reseaech.Acta Otolaryngol, 1994,114:245-253.

3孔维佳, Schrott-Fischer A.γ-氨基丁酸在大鼠前