【摘要】目的探讨卡铂的耳毒性机理。方法8只灰鼠中5只按100 mg/kg腹腔注射卡铂，3只作正常对照，注药后48小时处死。对分离的耳蜗基底膜进行了不同的细胞化学染色，反应结果在透射电镜下观察。结果与对照耳相比，卡铂组的内毛细胞显示钙离子激活的ATP酶活性增强，而钠钾离子激活的ATP酶、碱性磷酸酶和葡萄糖-6-磷酸酶的活性降低；外毛细胞则显示钙离子激活的ATP酶和碱性磷酸酶的活性增强，葡萄糖-6-磷酸酶的活性降低，而钠钾离子激活的ATP酶无明显改变。结论毛细胞中一系列磷酸酶的活性变化提示卡铂引起的钙离子释放可能导致了离子紊乱和能量代谢的障碍。

Mechanisms of Carboplatin Ototoxicity Suggested by Cytochemical Analysis

Ding Dalian, Zheng Xiangyang, Wang Jian ,et al.

(Center for Hearing and Deafness ,State University of New York at Buffalo)

【Abstract】ObjectiveTo examine the mechanisms of carboplatin ototoxicity.MethodsForty- eight hours following administration of Carboplatin(100 mg/kg),5 Carboplatin-treated chinchillas, together with 3controls,were sacrificed.After dissection of the organ of Corti,the samples were processed for a series of cytochemical staining,and observed under transmission electron microscopy.ResultsCompared to normal ears, the Carboplatin-treated ears showed increased Ca^＋＋-ATPase,decreased Na^＋K^＋-ATPase,alkaine phosphatase and glucose-6-phosphatase activities in inner cells.The outer hair cells,however,incurred increased activities of Ca^＋＋-ATPase and alkaline phosphatase,decreased activity of glucose-6-phosphatase with unchanged activity in Na^＋K^＋-ATPase.ConclusionThe results suggest that the released calcium may result in ion inbalance and impediment of energy metabolism.

【Key words】CytochemistryCarboplatinInner ear

卡铂选择性破坏灰鼠内毛细胞的现象已为许多实验所证实^［1.2］。最近的研究发现无论在耳蜗还是在前庭，卡铂的早期耳毒性损害都是始发于Ⅰ型传入神经末稍^［3，4］。提示内毛细胞的破坏可能与其Ⅰ型传入神经系统的损害有关。另外，卡铂耳毒性早期特异性抑制灰鼠内毛细胞中脱氢酶活性的现象也说明能量代谢障碍可能是造成毛细胞坏死的重要原因^［5］。文中用酶细胞化学技术观察了卡铂耳毒性作用早期所引起的毛细胞几种酶的变化。

1材料与方法

1.1动物与用药：5只成年灰鼠(体重在534～689 g)按照每公斤体重100 mg的剂量腹腔注射卡铂，用药后48 h处死。另外3只成年灰鼠做为正常对照。麻醉动物被断头后，迅速取出听泡。在蜗尖钻孔并打开蜗窗和前庭窗。从蜗尖孔灌入含1%戊二醛和4%甲醛的0.1 M二甲砷酸盐缓冲液(4℃)，并将耳蜗浸入上述固定液于4℃冰箱内固定1小时。在0.1 M二甲砷酸盐缓冲液(4℃)中分离取出基底膜。将基底膜切成几个片段以分别用于不同的酶细胞化学孵育反应。

1.2酶细胞化学反应：

1.2.1钙离子激活的ATP酶(Ca^＋＋-activited ATPase)孵育液含有80 mM Tris-马来酸缓冲液(pH7.3)，8%蔗糖、2 mM硝酸铅、1 mM ATP、0.2mM硫酸镁和1 mM氯化钙。将基底膜片段浸入上述孵育液在37℃恒温箱内温育30 min。另一种基底膜片段浸入不含ATP底物的反应液温育相同的时间作为对照

1.2.2钠钾离子激活的ATP酶(Na^＋K^＋-activited ATPase)孵育液含有100 mM Tris^-马来酸缓冲液(pH9.0)、20 mM氯化锶、10 mM氯化钾、10 mM氯化镁和5 mM对硝基苯硫酸钠。将基底膜片段浸入上述孵育液在37℃恒温箱内温育60 min，再用0.2 M Tris-马来酸缓冲液漂洗标本3次，然后浸入2%硝酸铅溶液5 min，再以含有7.5%蔗糖的0.2 M Tris-马来酸缓冲液漂洗标本3次。对照染色的基底膜段浸入含有10 mM乌本甘的孵育液温育相同的时间。

1.2.3碱性磷酸酶(Alkaine phosphatase)孵育液含有2 ml 0.2 M Tris-马来酸缓冲液(pH 9.0)，2 ml 1.25%一甘油磷酸钠和1.3 ml 1%硝酸铅。样品在37℃孵育液中温育30 min，再用0.1 M二甲砷酸盐缓冲液漂洗。对照染色孵育液中不含β一甘油磷酸钠。

1.2.4葡萄糖-6-磷酸酶(Glucose-6-phosphatase)孵育液含有40 mM Tris-马来酸缓冲液(pH 6.5)、10 mM葡萄糖-6-磷酸二钠盐、3.6 mM硝酸铅和30 mM蔗糖。样品在37℃孵育液中温育60 min后再用0.1 M二甲砷酸盐缓冲液漂洗。对照染色孵育液中不含葡萄糖-6-磷酸二钠盐。

1.3电镜样品制备将经细胞化学反应后的样品浸入1%四氧化锇二甲砷酸盐缓冲液后固定60 min再用缓冲液漂洗。然后经梯度酒精脱水后用Epon812包埋。常规制备超薄切片后不再行铅染和铀染，以避免非特异性高电子密度产物。透射电镜下观察酶细胞化学反应产物并摄影。

2结果

上述四种酶的对照染色均呈阴性，说明本组染色具有较好的组化反应专一性。钙离子激活的ATP酶主要定位在毛细胞的质膜和内膜系统。在正常灰鼠的内外毛细胞中很少，而在卡铂耳中毒灰鼠的内外毛细胞中明显增多(图1)。钠钾离子激活的ATP酶主要定位在毛细胞的质膜和内质网。正常灰鼠和卡铂耳中毒灰鼠的外毛细胞中的钠钾离子激活的ATP酶未见明显不同，但在内毛细胞和血管纹边缘细胞的钠钾离子激活的ATP酶明显减弱(图2)，碱性磷酸酶在卡铂耳中毒灰鼠的内毛细胞明显减弱，但在外毛细胞的内质网却有所增强(图3)，葡萄糖-6-磷酸酶主要定位在内质网和微粒体，卡铂耳中毒内外毛细胞中的葡萄糖-6-磷酸酶有所减弱(图4)。

图1A：正常对照灰鼠内毛细胞中的钙离子激活的ATP酶；

B：卡铂耳中毒灰鼠内毛细胞中的钙离子激活的ATP酶；

C：正常对照灰鼠外毛细胞中的钙离子激活的ATP酶；

D：卡铂耳中毒灰鼠外毛细胞中的钙离子激活的ATP酶

图2A：正常对照灰鼠内毛细胞中的钠钾离子激活的ATP酶；

B：卡铂耳中毒灰鼠内毛细胞中的钠钾离子激活的ATP酶；

C：正常对照灰鼠血管纹细胞中的钠钾离子激活的ATP酶；

D：卡铂耳中毒灰鼠血管纹细胞中的钠钾离子激活的ATP酶；

图3A：正常对照灰鼠内毛细胞中的碱性磷酸酶；

B：卡铂耳中毒灰鼠内毛细胞中的碱性磷酸酶；

C：正常对照灰鼠外毛细胞中的碱性磷酸酶；

D：卡铂耳中毒灰鼠外毛细胞中的碱性磷酸酶

图4A：正常对照灰鼠内毛细胞中的葡萄糖-6-磷酸酶；

B：卡铂耳中毒灰鼠内毛细胞中的葡萄糖-6-磷酸酶；

C：正常对照灰鼠外毛细胞中的葡萄糖-6-磷酸酶；