关键词： 端粒酶；头颈肿瘤；鳞状细胞癌；端粒重复序列液体闪烁计数

摘要目的：了解头颈部鳞癌及其颈淋巴结转移癌端粒酶的表达情况，探讨端粒酶活性定量分析在头颈部鳞癌诊断中的价值。方法：采用端粒重复序列液体闪烁计数法检测端粒酶活性。共检测取自25例头颈部鳞癌患者的组织样本55份，其中7例患者同时取有原发癌及其颈淋巴结转移癌两份样本，以23份正常组织作为对照。结果：①32份原发鳞癌组织中端粒酶活性(cpm值)在1 000以上的28份，除2份外，均明显高于正常组织；23份正常组织的端粒酶活性均在1 000以下，除1份外均低于所有鳞癌组织(P＜0.05)。②7份颈淋巴结转移癌与其原发癌组织同样具有较高的端粒酶活性(P＞0.05)。结论：①液体闪烁定量分析方法检测头颈部鳞癌端粒酶活性敏感性较高，对头颈部恶性肿瘤的辅助诊断具有一定价值。②转移癌细胞同样具有较高的端粒酶活性。

Quantitative assay of telomerase activity in head

and neck squamous cell carcinoma

ZHANG Song-zhiTENG Xue-jingZHANG Song

(Department of Otolaryngology, the Third Affiliated Hospital of Xinxiang

Medical College, Xinxiang 453003)

DONG Ming-min

(Department of Otolaryngology, the First Affiliated Hospital of Henan

Medical University)

CHEN Tie-he

(Shanghai Naval Medical Institute)

AbstractObjective:To detect and quantify telomerase activity in tissues from head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC),and to explore whether the levels of telomerase activity can be a useful marker for cancer risk assessment in HNSCC. Method:The levels of telomerase activity of 55 fresh specimens obtained from 25 patients with HNSCC were detected by the method of telomeric repeat scintillation radioactive count, including 25 primary tumors, 7 samples of neck metastases and 23 corresponding normal tissues as control. In 7 patients, both primary and metastatic tumors were obtained. The levels of telomerase activity were determined with a liquid scintillation counter. The basic principle of the technique is that a G-rich oligonucleotide strand of telomeric sequence is used as primer,³H-dTTPs are incorporated into the products while telomerase elongates the primers, and then free ³H-dTTPs are removed by rinsing step, finally radioactive count per minute (cpm) of products is detected, and the levels telomerase activity can be evaluated according to the value (cpm). Result:①The levels of telomerase activity (cpm) in tissues with HNSCC were significantly higher than those in the normal tissues (P＜0.05); ②The levels of telomerase activity in the primary tumors were higher than those of their neck metastases, but the difference was not statistical significance (P＞0.05); ③The levels of telomerase activity in the neck metastases were remarkably higher than those in the normal tissues (P＜0.05).Conclusion:①Detection of telomerase activity in HNSCCs can be a useful marker for cancer assessment. ②To quantify telomerase activity may have clinical diagnostic value for HNSCC. ③The levels of telomerase activity in the metastatic lymph nodes were higher.

Key wordsTelomeraseHead and neck neoplasmsSquamous cell carcinomaTelomeric repeat scintillation counting

端粒酶是一种核糖核蛋白复合体，系依赖RNA的DNA聚合酶，能以自身的RNA为模板重新合成端粒重复序列，以补偿细胞分裂时丢失的端粒。1994年Kim等^〔1〕改进了端粒酶检测方法，使其灵敏度大幅提高，并发现端粒酶活性仅特异性地存在于恶性肿瘤组织、永生化细胞和生殖组织中。头颈部恶性肿瘤端粒酶研究的报道较少^〔1～3〕，尤其在颈淋巴结转移癌中表达的报道罕见。目前所用的方法多为端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)，是定性的或半定量的，尚未见到定量检测的报道。本研究用定量的端粒重复序列液体闪烁计数法^〔4〕，旨在了解端粒酶在头颈部鳞癌组织的表达情况，为头颈部恶性肿瘤的诊断提供新的手段。

1材料与方法

1.1样品采集

共取来自25例头颈部鳞癌患者的组织样本55份，其中原发癌样本25份，7例患者同时取原发癌及其颈淋巴结转移癌两份样本，23份正常组织作为对照。癌组织的病理学分级、分期按国际抗癌协会(UICC)TNM分类标准(1987)。其中1份新鲜样本迅速置于液氮中(或-40℃以下)冻存，供端粒酶活性检测用。

1.2样品处理

待测组织称重后，剪碎成1～2 mm的小块，按1∶4加入细胞裂解液，13 500 r/min匀浆，3 000×g，4℃，离心5 min，取上清液。用CBBG法测定上清液中的蛋白含量，并调节蛋白含量为1 g/L。此液置-20℃保存，用以端粒酶活性分析。

1.3样品端粒酶活性分析

取2支离心管，分别作测定管和对照管。二管各加入待测样品10 μl，对照管先加入2.0 μl终止液，在30℃恒温箱中反应10 min后，二管各加入10 μl底物溶液，混匀，35℃恒温反应60 min。反应结束时，测定管加入2 μl终止液。然后将反应混合物移到直径1.0 cm玻璃滤纸中央，置于80℃干燥箱中固定80 min。然后将滤纸片置于负压抽滤器上，用沉淀性洗涤液冲洗，除去游离的³H-dTTP。再次置于80℃干燥箱中40min，烘干。最后把滤纸片放入闪烁瓶（内含3.0 ml闪烁液）中，用液体闪烁计数仪测定cpm(radioactive count per minute)值。

1.4主要试剂及设备

细胞裂解液：20 mmol/L Tris-Cl, pH8.3,3.0 mmol/L MgCl₂, 5 mmol/L TT,100 mmol/L KCl, 100 mmol/L NaCl,0.2 mmol/L PMSF(phenyl methylsulfomyl fluoride，华美生物工程公司)，10 000 u/L RNasin,1.0% NP-40, 10%甘油,2.0 mmol/L 亚精胺。

底物溶液：2.0 mmol/L dATP,2.0 mmol/L dGTP,5.0 μmol/L ³H-dTTP(3.7×10¹⁰ mBq/mmol，上海原子核研究所),2.0 μmol/L d(TTAGGG)₃(上海细胞生物学研究所合成)。

终止液：100 mmol/L EDTA,10 mmol/L Tris-Cl,pH 7.0,0.1 g/L RNase A(华美生物工程公司)，1.0 mg puc19-t4。

其它：液体闪烁计数仪等。

2结果

鳞癌组织的端粒酶活性(cpm)(1 775.28±905.71)明显高于正常组织(503.48±155.37)，差异有显著性意义(P＜0.05)。32份鳞癌组织中端粒酶活性(cpm)在1 000以上的28份，除2份外，均明显高于正常组织；23份正常组织的端粒酶活性均在1 000以下，除1份外均低于鳞癌组织。

7份原发癌(2 438.57±1 423.00)与其颈淋巴结转移癌(1 291.43±360.91)端粒酶活性无显著性意义(P＞0.05)，颈淋巴结转移癌同样具有较高的端粒酶活性。

3讨论

3.1端粒酶激活与头颈部鳞癌的发生

研究表明，全身许多部位的恶性肿瘤组织中端粒酶普遍表达，而相应的正常组织则无表达，提示端粒酶激活在恶性肿瘤的发生中起着十分重要的作用。本研究显示，头颈部鳞癌组织中端粒酶活性较正常组织明显增高，说明端粒酶的定量检测可区分正常组织与头颈部的鳞癌组织，端粒酶可作为头颈部鳞癌的生物学标志。本研究进一步证实了端粒酶的表达与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。

3.2头颈部原发癌与颈淋巴结转移癌端粒酶活性

本研究还发现，颈淋巴结转移癌与其原发癌组织同样具有较高的端粒酶活性，目前罕见类似的报道。表明，转移癌细胞同样具有永生化能力，转移癌组织的端粒酶同样存在普遍激活现象。

3.3端粒酶活性定量检测的临床价值

目前，国内外报道的临床组织样本端粒酶活性分析资料都是用TRAP法得来的，由于其本身的限制，分析结果多以定性方式表示，只有少数用半定量的方式，所以无法与本文的定量结果做直接比较。如果以1 000（cpm）为界将定量数据转化为定性数据^〔4〕，各组的端粒酶阳性率分别为：正常组为0；鳞癌组为87.5%，与TRAP法所测HNSCC样本的分析结果相近，分别为87.5%^〔1〕、87.5%^〔2〕、80%^〔5〕和90%^〔3〕。表明端粒重复序列液体闪烁计数法能够代替TRAP法或其改良法^〔1，6〕。

3.4液闪测定法的优缺点

TRAP法是在端粒酶延伸产物PCR