关键词： 一氧化氮；一氧化氮合酶；耳蜗；噪声

摘要目的：探讨一氧化氮(NO)在噪声性聋发病中的作用。方法：用中高频连续稳态噪声制作噪声性聋的动物模型，用NADPH-黄递酶组织化学、原位杂交和Northern印迹法，观察噪声刺激对耳蜗一氧化氮合酶(NOS)表达的影响。结果：组织化学法显示NOS主要分布于内外毛细胞、螺旋神经节细胞和血管纹边缘细胞；原位杂交法发现NOSmRNA在内外毛细胞、螺旋神经节细胞胞浆内均可见阳性染色，但血管纹边缘细胞无阳性染色；Northern印迹法显示实验组NOSmRNA表达较对照组增强。结论：听觉传入径路上存在Glu:NMDA受体，NO:cGMP通路，噪声刺激诱发的NO合成具有介导神经中毒作用，血管纹边缘细胞能合成一定量NO,对耳蜗微循环具有调节作用。

The effect of noise exposure on the expression

of NOSmRNA in the cochlea

SUN De-yiLI Xue-pei

（Department of ENT,the Third Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100083）

AbstractObjective:To study the effect of NO in noise-induced deafness.Method:The effect of noise exposure on the expression of NOSmRNA in the guinea pig cochlea was observed with NADPH-diaphorase histochemistry staining,NOSmRNA hybridization in situ and Northern blotting analysis.Result:NADPH-diaphorase histochemistry indicated that NOS mainly presents in the inner hair cells, outer hair cells of Corti′s organ, spiral ganglion cells and the marginal cells of stria vascularis in the guinea pig cochlea; NOSmRNA hybridization in situ showed that there is positive signal in the inner hair cells, outer hair cells and spiral ganglion cells, but there is no positive signal in the stria marginal cells of vascularis; Northern blotting showed that the expression of noise exposure group is more intensive than that of the control group.Conclusion:There is a Glu :NMDA receptor ,NO: cGMP pathway in the cochlear afferent possibly; noise exposure induced overproduction of NO mediates the effect of neurotoxicity; the marginal cells of stria vascular produce and release NO to regulate the microcirculation of the cochlea.

Key wordsNitric oxideNitric oxide synthaseCochleaNoise

1980年Furchgott首次报道了血管内皮可产生并释放一种血管舒张因子，其后证明一氧化氮(NO)即血管内皮舒张因子。随着研究的深入又证实NO在神经系统中有广泛分布，参与众多生理功能,是神经系统重要的时空信使。然而NO的过量产生或病理刺激时可产生神经中毒，并参与兴奋性氨基酸对神经细胞的毒性作用。在听觉系统中有关NO的研究较少，尤其是病理条件下对耳蜗一氧化氮合酶（NOS）表达的影响尚未见报道。我们用组织化学、原位杂交和Northern印迹法，观察噪声刺激后耳蜗NOS的表达。现报道如下。

1材料与方法

择杂色豚鼠36只，体重280～350g，耳廓反射灵敏，雌雄不拘。随机分为实验组和正常对照组。

实验组动物每日给中高频连续稳态噪声8 h，共4周，声强为105 dB，对照组动物放在与实验组相同的环境中，不给噪声刺激，给声前和给声4周后均作ABR(MadsenERA2250型)检测反应阈。20%乌拉坦腹腔注射麻醉，经心灌流预冷的生理盐水，冲出体内血液至肝脏变白，再灌流4%多聚甲醛约20 min。取出耳蜗，放入4%多聚甲醛中固定24 h后转入20% EDTA脱钙5 d。每只豚鼠各取一只耳蜗，OCT包埋，行20μm恒冷冰冻切片，裱于用APES涂布的载玻片上，-20℃保存备用。耳蜗NADPH-黄递酶常规染色，光镜下观察并摄像；对照组省去β-NADPH,其他试剂不变。

NOScRNA探针制备：本实验室构建NOSc-DNApGEM-3Zf(+)重组质粒，NOS寡聚核苷酸引物依据Bredt发表的大鼠小脑cNOS核苷酸序列，由中科院微生物所合成。用地高辛标记RNA检测试剂盒合成NOScRNA探针，用随机引物法制备³²P-NOScDNA探针(地高辛标记RNA检测试剂盒，DNA随机引物试剂盒购自Boehringer Mannheim公司)。把地高辛-NOScRNA反义链探针与耳蜗切片组织的NOSmRNA常规杂交，显色后光镜下观察并摄像。从实验组与对照组中各取10只耳蜗合并，应用一步快速热酚抽提法提取耳蜗总RNA,各组取总RNA 30 μg经甲醛变性凝胶电泳，RNA毛细管法转膜（硝酸纤维素膜）后常规与³²P标记的NOScDNA探针杂交，-70℃曝光48 h。

2结果

实验组动物左耳噪声刺激前反应阈为(49.0±3.38)dB SPL，右耳为(49.0±2.10)dB SPL。噪声刺激后左耳听阈为(75.0±5.35)dB SPL，右耳为(74.67±3.52)dB SPL。经配对t检验，左右耳差异有高度显著性(P＜0.01)，说明建立的噪声性聋动物模型可靠。而对照组动物反应阈无明显变化。

耳蜗NADPH-黄递酶组织化学染色：实验组与对照组耳蜗各转均可见NOS阳性染色反应，呈蓝色。在光镜下观察各组染色无差异，阳性染色分布于内毛细胞(IHC)、外毛细胞(OHC)、螺旋神经节细胞(SGC)的胞浆内，由螺旋神经节细胞胞体发出的突起清晰可见，血管纹(SV)边缘细胞呈NOS强阳性染色反应。对照组实验呈阴性（图1）。

耳蜗NOSmRNA原位杂交：用cNOScRNA反义链探针杂交，在实验组和对照组耳蜗各转均可见阳性染色，呈蓝紫色。在光镜下观察，各组染色无差别，阳性染色分布于IHC、OHC、SGC的胞浆内，血管纹未见有阳性染色颗粒（图2～4）。

Northern印迹杂交：Northern印迹分析，经图像分析仪扫描定量,结果显示实验组和对照组的平均光密度值(OD)较为接近，实验组为0.4173，对照组为0.3985。而积分光密度值(IOD)两组有差异，实验组为2476.0，对照组为1791.1。说明实验组NOSmRNA的表达较对照组增强。

3讨论

NO作为神经系统的信使物质已被证实。有研究表明， NOS除在耳蜗局部分布外^〔1〕，听觉系统低级中枢核团内亦有NOS分布^〔2〕，这一特点与谷氨酸在听觉系统的分布十分相似。因此推测听觉系统合成的NO可能起神经递质或调质作用，即谷氨酸可能通过NO来发挥作用。

NO主要是通过NMDA（N-甲基-D-天门冬氨酸）受体发挥作用。Garthwaite(1988)发现小脑中突触后NMDA受体兴奋引起NO释放，并导致cGMP增加，成年大鼠小脑切片在基础条件下的cGMP浓度可以因为阻断NMDA受体或抑制NOS活性而显著减少。耳蜗内同样存在着NMDA受体，并已从多方面证实谷氨酸是听觉传入径路上的神经递质^〔3〕。兴奋性氨基酸谷氨酸通过激活NMDA受体，生成NO，促进cGMP的产生，发挥生理功能。因此推测内耳可能存在Glu:NMDA受体，NO:cGMP通路，该通路调节NO的基态释放，维持耳蜗的生理功能^〔4〕。但在病理条件下由于NMDA受体的过度激活而诱发合成的NO，具有介导神经中毒作用。

高强度噪声激活NMDA受体，同时使耳蜗内兴奋性氨基酸过度释放，后者作用于NMDA受体，导致兴奋性氨基酸的激活毒性。Northern印迹结果表明噪声刺激后耳蜗内NOSmRNA表达增强，即存在着NO释放增多。NOS竞争性抑制剂L-NNA（N-硝基-L-精氨酸）能减轻NMDA受体和相关兴奋性氨基酸引起的神经中毒。用神经毒性剂量的兴奋性氨基酸处理耳蜗后的组织病理变化类似于噪声损伤后的病理变化，用谷氨酸灌注耳蜗产生的高频听阈升高，其类型与噪声诱导的高频听阈升高类似^〔1，5〕。因此，NO不仅介导中枢神经系统兴奋性氨基酸的过度激活毒性，而且也介导耳蜗内兴奋性氨基酸的过度激活毒性。噪声刺激下，用NMDA受体阻断剂能减轻兴奋性氨基酸的神经中毒。这一见解为噪声性聋的防治提供了药理学基础，同时也明确了NO在噪声对听觉损伤中的作用，有助于了解声信号传递的调控机制。

NOS组织化学表明血管纹处富含NOS，与鸟苷酸环化酶在血管纹的分布一致，提示NO可能与内耳微循环调节有关。本研究原位杂交中使用的是神经型NOScRNA探针，结果在血管纹边缘细胞无阳性信号，揭示了血管纹NOS为内皮属性，释放的NO起舒张血管平滑肌作用。本研究基于研究方法上的原因，未能证实血管纹内皮细胞NOS表达的动态变化。同时也应考虑除NO作用外，噪声刺激时还可能有多种因素参与对耳蜗血流的调节。

图1 对照组NADPH-黄递酶组织化学；可见内毛细胞，外毛细胞，螺旋率节细胞，血管纹边缘细胞和神经纤维呈蓝色阳性染色反应，螺旋缘的齿间细胞和内外柱细胞变有阳性染色

图2 帝验组原位杂交，螺旋神经节细胞浆中可见蓝紫色阳性染色颗粒