文献报道，线粒体DNA (mtDNA) 12SrRNA基因A1555G点突变及tRNA Ser^(UCN)基因A7445G突变是导致非综合征性母系遗传聋的分子遗传学基础。近期,我们在对以往报道的江苏省淮阴县方氏遗传聋大家系进行系谱复核和听力学抽样复查后,修正了以前所持常染色体显性遗传聋的观点,将其遗传模式确定为母系遗传——线粒体遗传。为进一步寻找与该家系耳聋表型相应的mtDNA突变,本文采用PCR、PCR-RFLP(限制性内切酶消化)、PCR-SSCP(单链构象多态性分析)技术,对文献报告的上述两个mtDNA位点进行了系统研究，报告如下。

1材料与方法

研究对象: 在以往报道的遗传聋大家系中选择一耳聋外显率最高的分支家系共41例为研究对象,其中母系亲属20例(含耳聋患者17例) ,父系亲属16例,配偶5例。同时采集100例分别来自江苏省淮阴地区和南京市的听力正常者外周血样,对mtDNA 1555位点进行了检查。

标本采集及DNA提取: 取外周静脉血5～10 ml,4℃ ACD抗凝。红细胞裂解液处理血样,分离淋巴细胞,蛋白酶K和SDS裂解液处理后消化过夜,按酚/氯仿抽提法提取DNA。

PCR扩增：根据所扩增mtDNA基因片段的不同,设计两对引物。mtDNA 1555位点引物为nt 1326-1355和nt 1684-1704。mtDNA 7445位点引物为nt 7178-7198和nt 7821-7840。PCR反应条件：20 μl扩增体系中含10×PCR缓冲液2 μl，模板DNA 2 μl,2 mmol/L dNTPs 1.5 μl，15 mmol/L MgCl₂ 2 μl,25 pmol/μl mtDNA 1555或7445位点上、下游引物各1 μl,ddH₂O补至体积19.8 μl,94℃预变性4 min,加入TagDNA聚合酶0.2 μl(1 U),置PCR仪中扩增35个循环,72℃延伸10 min,2%琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物。

PCR-RFLP: 取纯化后1555或7445位点PCR产物5～10 μl,在37℃以Alw26I(10 U)或Xbal(10 U)酶切1 h,2%琼脂糖凝胶电泳1 h(100 V)观察酶切结果。

PCR-SSCP银染: mtDNA1555位点或mtD-

本课题由国家自然科学基金资助(项目编号：39770402)NA7445位点PCR产物5 μl，甲酰胺10 μl，终止液5 μl，6%聚丙烯酰胺凝胶电泳约6 h,按常规方法银染,UVP凝胶成像分析系统观察。

2结果

应用引物nt1326-1355和nt1684-1704扩增家系所有成员及100例正常对照,均可见包括mtDNA 1555位点的一条379 bp扩增带;应用引物nt7178-7198和nt7821-7840扩增家系全体成员,扩增产物为包括mtDNA 7445位点在内的一条662 bp的扩增带。

PCR-RFLP结果: 正常个体mtDNA扩增产物1326-1704片段中存在Alw26I酶切位点,可经酶切产生153 bp和226 bp两条带,当存在A1555G突变时，该酶切位点消失,结果仍为379 bp的一条带。同样,正常个体mtDNA扩增产物7178-7840片段中存在Xbal酶切位点,可经酶切产生400 bp和262 bp两条带,当7445位点发生了A→G的突变时则仅见662 bp的一条带。应用Alw26I和Xbal酶消化结果显示,本核心家系中所有母系亲属均存在mtDNA A1555G突变,而家系中父系亲属、配偶及100例正常对照1555位点碱基为A。41例家系成员均未检出mtDNA A7445G突变。

PCR-SSCP结果: 家系中mtDNA A1555G突变阳性者与配偶1326-1704扩增片段的SSCP带型有显著性差异(图1) ,证实耳聋患者及突变携带者mtDNA 1326-1704片段中有碱基突变产生。而全体家系成员mtDNA 7178-7840扩增片段的SSCP检查未见异常带型。

图1mtDNA12SrRNA基因1555位点PCR-SSCP结果(1～3：家系配偶；4～9：耳聋患者)

3讨论

江苏省淮阴县遗传聋大家系是至今世界文献报道的最大耳聋家系之一。系谱分析表明,本文核心家系的致聋突变可追溯到五代前一方氏女性祖先,该女育有7女1子,其7个女儿的后代中均出现按母系遗传方式传递的耳聋患者,提示该女可能是致聋基因的携带者,而该家系的遗传缺陷可能位于线粒体。为此,我们应用PCR、PCR-RFLP、PCR-SSCP技术,对该非综合征性母系遗传聋大家系的一分支家系进行了系统的分子遗传学研究,发现全部母系亲属均存在mtDNA 12 SrRNA基因1555位点A→G的突变,而父系亲属、配偶以及100例分别取自家系采集地和南京地区的正常个体血样中未检测到A1555G突变,提示A1555G突变与本家系遗传聋发生密切相关。虽有研究认为mtDNA tRNA Ser^(UCN)基因7445位A→G突变也是导致非综合征性母系遗传聋的致病因素之一,但本文结果表明该突变与本家系致聋无关。

非综合征性耳聋的发生是遗传因素和环境因素相互作用的结果,但在特定人群中两者对耳聋表达所起的作用有所差异。在目前文献报道的许多mtDNA 12SrRNA基因1555位点突变致聋家系中，聋基因携带者仅在接触氨基甙类抗生素（AmAn）后才出现听力下降 ,提示1555位点突变只是造成个体的易感性,而AmAn的诱导才最终促发聋基因的表达。本家系遗传聋特点则与此明显不同,核心家系耳聋外显率高达85%(17/20) ,17例聋患者中仅4例耳聋前有明确AmAn应用史,而且1987年调查该大家系中还有14%的先天性聋,说明该母系遗传聋家系中遗传因素是致聋的主要因素,单纯线粒体突变即可导致耳聋发生，可见该家系的遗传聋是十分严重的。

研究认为，mtDNA功能在很大程度上受核基因组的调控，因此，对本家系成员进行全基因组扫描将有助于进一步阐明非综合征性母系遗传聋的分子机制。相关研究正在进行中。

(收稿 1999-12-22)