聚合酶链反应(PCR）技术的诞生，为分子生物学的发展开僻了新的途径。新近，我们应用原位PCR对喉部病变的陈旧蜡块标本进行了乳头状瘤病毒（HPV）DNA的检测，并就实验的一些体会作一总结。

1材料和方法

1.1材料选择

21例经HPV_6、11、18型特异引物PCR检测为阳性的喉良、恶性肿瘤蜡块标本（由301医院病理科提供）。每个标本作3个连续切片，片厚4 μm，分别进行HE、ISH、PCR-ISH检测。阳性对照标本为HPV_6、11、18阳性的尖锐湿疣和宫颈癌；阴性对照标本为HPV阴性的喉癌及乳头状瘤。

HPV_{6、11、16、18}型E₆引物，合成于赛百盛公司；Taq DNA聚合酶购于军事医学科学院；dNTPs购于岳泰公司；地高辛DNA标记及检测试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司。

1.2原位PCR检测

步骤：石蜡切片脱蜡至水，0.2 M HCl 10 min，0.01M PBS洗5 min×2次，2 μg/ml蛋白酶37℃消化10 min，0.2%甘氨酸10 min，4%多聚甲醛10 min，PBS洗5 min×2次，梯度乙醇脱水；室温干燥，切片置于65℃，加 40 μl PCR反应液（0.2 μM dNTPs、4 μl 10×Buffer、20 pmol引物、2 u Taq DNA聚合酶，加水至40 μl）。94℃变性3 min，PCR 30个循环（94℃ 1 min，45℃ 1 min，72℃ 1.5 min）；72℃延伸7 min。4%多聚甲醛后固定10 min，PBS洗5 min×2次，梯度乙醇脱水，室温干燥。

原位杂交：利用HPV_6、11、18 E₆引物PCR扩增产物，长度分别为134、157、183碱基，按试剂盒说明采用随机引物法标记地高辛，膜杂交检测标记效率。

步骤：石蜡切片脱蜡至水，0.2 M HCl 10 min，0.01 M PBS洗5 min×2次，2 μg/ml蛋白酶37℃消化10 min，0.2%甘氨酸10 min，4%多聚甲醛10 min，PBS洗5 min×2次，梯度乙醇脱水；室温干燥，切片滴加15 μl预杂交液42℃湿盒30 min，甩去预杂交液，滴加杂交液10 μl(探针浓度0.5ng/μl),盖上盖玻片；100℃变性10 min，冰浴1 min，42℃杂交20 h，2×SCC 55℃10 min×2次，0.05×SCC 0℃5 min×2次，缓冲液II 5 min×2次；加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(1∶500)37℃30 min，缓冲液II 5 min×2次，缓冲液II 5 min×3次，NBT / BCIP暗处显色，伊红复染。

阴性对照：阴性对照标本，ISH阴性标本不加引物或不加Taq DNA聚合酶进行PCR。

2结果

经原位PCR检测，有95.2%(20/21)的标本HPV DNA阳性。 11 例乳头状瘤中,19例样本在浅层上皮细胞核中检出病毒DNA序列；2例在全层上皮细胞核中检出HPV DNA序列。阴性对照(包括已知阴性标本；未加引物及DNA聚合酶进行扩增)，均未检出HPV DNA序列。

3讨论

本文用存档石蜡切片标本作原位PCR检测，获得了较满意的结果，也为喉部病变分子病理学的研究提供了新途径。由于PCR步骤较复杂，一些关键环节的失误就可能影响到结果，因而目前应用该方法的成功率还不高。我们体会：组织切片在进行原位扩增前，用蛋白酶进行适当预处理是一个关键步骤。酶消化的浓度和时间要适当，消化过度，阳性信号虽然明显，但组织结构破坏严重，影响结果观察；而消化不全则影响检出率。我们曾根椐Nuovo等(1994)报道，采用类似的酶浓度及消化时间，但效果不理想。考虑可能组织结构的不同对蛋白酶消化的效果有一定影响。因而具体组织在用蛋白酶消化时，应采用各种不同的浓度和时间作比较，以确定最佳条件。

原位PCR反应条件：与液相PCR反应条件基本相同，先摸索好液相PCR反应条件后再进行原位PCR。原位扩增的延伸步骤较液相PCR可适当延长。循环次数一般采用25～30个循环即可到达平台期，增加扩增次数并不能增强检测信号。

扩增后的探针杂交温度：我们采用的探针是用地高辛标记的纯化PCR产物，片段较长(135～187 bp)，杂交温度对于杂交效率影响很大，过高或过低都可能导致假阴性。因此具体探针要摸索一个适合自己的温度。

杂交后的洗脱条件：洗脱条件对于结果的背景有直接影响。低严格洗涤条件虽然增强了阳性信号，但易形成散在非特异背景。我们采用了高严格洗涤方法，获得较低背景。

苏慧慈等(1995)报道的原位PCR，综合了PCR的高灵敏性及原位杂交(ISH)的特异性，它可在组织切片上对目的基因进行扩增，并在切片上检测扩增产物，为临床诊断及研究提供了一种新的方法。但因其步骤较复杂，目前还处于实验阶段，有待于进一步的完善。我们的结果也提示，原位PCR是一个敏感的分子病理学的研究方法，本文所建立方法可用于临床的HPV检测。

(收稿 1999-11-12)