关键词： 鳞状细胞癌；头颈部肿瘤；端粒酶；分子生物学标志物

摘要目的：研究原发头颈部鳞癌及相应癌旁组织中端粒酶活性表达，探讨其作为头颈部鳞癌分子生物学标志物的可能性。方法：采用TRAP-PCR-ELISA，对32例原发头颈部鳞癌及15例癌旁组织进行端粒酶活性检测。结果：32例原发头颈部鳞癌中，27例端粒酶活化，阳性率为84.4%；15例癌旁组织中5例端粒酶活化，阳性率为33.3%。有淋巴结累及者端粒酶阳性率(86.7%)高于无淋巴结累及者(82.4%)，低分化鳞癌中端粒酶阳性率(90%)高于中高分化磷癌端粒酶阳性率(81.8%)，但差异均无显著性。端粒酶活性与肿瘤原发部位、临床分期无相关性。结论：端粒酶活化与头颈部鳞癌的发生发展有密切关系，其可望成为头颈部鳞癌的分子生物学标志物。

Telomerase activity in human head and neck squamous cell

carcinoma and adjacent tissues

LIU Jian-feng¹TAO Ze-zhang¹YANG Qiang¹XIAO Bo-kui¹ZHAN Han-zhang¹

(¹Department of Otolaryngology Head & Neck Surgery,the First

Affiliated Hospital of Hubei Medical University,Wuhan 430063)

AbstractObjective:To investigate the telomerase activity in human head and neck squamous cell carcinomas and their adjacent tissues and to explore its possibility of being tumor biological marker.Method:Thirty-two patient samples of primary head and neck squamous cell carcinoma and 15 adjacent tissues were assayed using TRA-PCR-ELISA for detection of telomerase activity.Result:Twenty-seven of 32 (84.4%) cancer samples and 5 of 15(33.3%) adjacent samples were telomerase positive (P＜0.05，Chi-Square Test).The frequency of telomerase activation was lower in cancer without lymphnode involvement (82.4%) than that with lymph node involvement(86.7%), but the difference has no statistical significance.Detection rate of telomerase activity in poor grading cancer (90%) is higher than that in moderate and high differentiation cancer (81.8%),although no statistical significance.No obvious correlation was found between the telomerase activity and the other clinical parameters such as primary site and staging.Conclusion:The finding of telomerase activity in 84.4% of primary head and neck squamous cell carcinoma samples is consistent with the concept of telomerase playing a key role in tumorigenesis.Further study is needed to determine the usefulness of this enzyme as a new molecular marker.

Key wordsSquamous cell carcinomaHead and neck neoplasmsTelomeraseMolecularbiological marker

近年来的研究表明端粒酶在肿瘤的发生发展中起着重要作用。国内对头颈部鳞癌端粒酶活性的有关报道尚少。本文采用TRAP-PCR-ELISA法对原发头颈部鳞癌及癌旁组织进行端粒酶活性检测，以探讨端粒酶活性与肿瘤生物学行为的关系。

1材料与方法

1.1标本来源

32例原发头颈部鳞癌组织和15例相应癌旁组织(距肿瘤切缘2 cm以外)，均取自我院1998年8月～1999年5月手术切除或活检标本。标本采取及制备均严格按试剂盒要求操作，避免交叉污染。每种标本分2份，用于端粒酶检测的标本离体后30 min内采集，液氮速冻，后转至-70℃冰箱贮存备用。另一份用于常规组织病理检查。

采用Telomerase PCR ELISA检测试剂盒(Boehringer Manheim)。

将标本从-70℃冰箱取出，用冰冻切片机切成10～15 μm厚的切片，取5片加入100 μl冰冻裂解液，充分混匀。置4℃冰箱2 h；4℃离心，16 000g 20 min，吸取上清，置-20℃保存备用。考马斯亮蓝法测定蛋白含量。

1.2TRAP-PCR-ELISA检测

取细胞提取液1～3 μl(蛋白含量50 μg)加入25 μl TRAP PCR扩增液，用无菌的DEPC处理的双蒸水补足至总体积50 μl。在PCR扩增仪上按以下步骤进行引物的延伸及扩增反应：25℃30 min，90℃50 min循环一个周期，再以94℃30 s变性，50℃30 s退火，72℃90 s延伸，共30个循环，最后72℃延伸10 min。取上述PCR产物5 μl进行ELISA反应。全自动酶标仪测其在波长450 nm和690 nm吸光度，得ΔA(450 nm-690 nm)值。

1.3结果判断

阴性对照ΔA(450 nm-690 nm)＜0.056，阳性对照ΔA(450 nm-690 nm)＞1.5，标本ΔA(450 nm-690 nm)＞0.2为阳性。

1.4统计分析

SPSS软件进行χ²检验，EP软件进行Fisher精确概率检验。

2结果

32例头颈部鳞癌组织中检出端粒酶阳性者27例，阳性率为84.4%；15例癌旁组织中检出端粒酶阳性者5例，阳性率为33.3%(P＜0.01)。

有淋巴结累及(86.7%)和无淋巴结累及(82.4%)，以及低分化鳞癌(90%)和中、高分化鳞癌(81.8%)端粒酶阳性率无统计学差异。肿瘤原发部位、临床分期与端粒酶阳性率无相关性(P＞0.05)。

3讨论

目前，在大多数肿瘤中均发现端粒酶活性，而在绝大多数正常体细胞中没有表达。端粒酶激活伴随着端粒稳定和细胞永生化，在肿瘤的发病过程中起着重要作用，研究发现67%～96%原发性头颈肿瘤有端粒酶活性表达。100%头颈部鳞癌细胞系存在阳性表达^〔1～6〕。本文资料表明，端粒酶在头颈部鳞癌中表达率为84.4%(27/32)，与文献报道类似，说明端粒酶激活在头颈部鳞癌的发生发展过程中，可能具有某种重要作用，并提示端粒酶有可能成为头颈部鳞癌的分子生物学标志物。

端粒酶与肿瘤分化的关系尚无定论。有人报道端粒酶与口腔肿瘤的分化程度相关^〔2〕。Reichman等^〔3〕也报道诱导分化能抑制端粒酶活性，均提示分化程度与端粒酶活性相关。但其他研究^〔5〕提示端粒酶活性与肿瘤分化无关。我们的研究显示，低分化鳞癌与中高分化鳞癌端粒酶阳性率无显著差异。

端粒酶活性表达与肿瘤分期关系尚不明确。Curran等^〔4〕报道，端粒酶的活性在口腔肿瘤的T₄与T₁、T₂间有显著差异。Cheng等^〔5〕检测鼻咽癌中端粒酶活性，表明Ⅰ期患者有较高的阳性率(80%)。有淋巴结转移患者阳性率(100%)明显高于无淋巴结转移患者(60%)。Thurnber等(1998)研究表明N₊较N₀有较强的活性。但加贺田博子等(1998)认为，端粒酶活性与头颈肿瘤的淋巴结状况和临床分期无关。本组研究结果显示，有无淋巴结累及端粒酶阳性率差异无显著性意义。而且端粒酶活性与肿瘤部位、临床分期无相关性。

端粒酶活性在癌旁组织中的表达。Curran等^〔4〕报道，口腔鳞癌癌旁正常上皮组织中端粒酶活性表达为35%(7/20)。Hohaus等^〔6〕在喉癌患者的远离病灶的正常组织中也发现了端粒酶活化。本组研究结果显示，15例头颈部鳞癌癌旁组织中有5例阳性，阳性率为33.3%(5/15)，与Curran报道相似，而且5例阳性标本对应的病理切片显示其为正常组织。癌旁正常组织端粒酶活化可能是因为这些癌旁组织处于亚临床癌变阶段，因而在常规组织病理上尚无异常表现。有必要对癌旁组织端粒酶阳性者及无淋巴结累及而端粒酶阳性者进行随访，观察有无复发及转移。

端粒和端粒酶活性研究是当前肿瘤研究的热点。它在肿瘤的发生发展中起到重要作用。本组研究结果表明，端粒酶活性表达与头颈部鳞癌发生有关，并提示端粒酶活性可望成为肿瘤特异性标志物。但是，对端粒酶活化与头颈部鳞癌的肿瘤生物学行为的关系需进一步深入研究。

参考文献

1，Sumida T,Sogawa K,Hamakawa H,et al.Detection of telomerase activity in oral lesions.J Oral Pathol Med,1998,27:111～115

2，Kannan S,Tahara H,Yokozaki H,et al.Telomerase activity in premalignant and malignant lesion of human oral mucosa.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,1997,6:413～420

3，Reichman T W,Albanell J,Wang X,et al.Downregulation of telomerase activity in HL60 cells by differenting agents is accompanied by increased expression of telomerase-associated protein.J Cell Biochem,1997,67:13～23

4，Curran A J,St Denis K,Irish J,et al.Telomerase activity in oral squamous cell carcinoma.Arch Otolaryngol Head Neck Surg,1998,124:784～788

5，Cheng P Y,Yuen P W,Nicholls J M,et al.Telomer