摘要目的：了解喉乳头状瘤组织内HPV_16/18的感染与抑癌基因p53变异的关系，以及HPV感染在喉乳头状瘤发病中的作用。方法：采用PCR和免疫组化技术，检测35例喉乳头状瘤组织中HPV_16/18 DNA及p53蛋白的表达。结果：24例组织中检出HPV_16/18 DNA(68.6%)；19例p53蛋白呈过度表达(54.3%)；在12例中同时检出HPV_16/18 DNA和p53蛋白过度表达(34.3%)。结论：提示HPV_16/18感染和p53变异与喉乳头状瘤的发生明确相关，其内在分子机理及临床意义有待进一步阐明。

Study on the association between HPV_16/18 and expression

of p53 protein in laryngeal papillomas

CHU Han-qi¹

(¹Department of Otolaryngology,Tongji Hospital,Tongji Medical University, Wuhan 430030)

E Reyt²

(ORL,Grenoble University Hospital,La Tronche 36400,France)

AbstractObjective:To understand the relationship between the expression of p53 protein and HPV_16/18 infection in laryngeal papillomas.Method:using PCR and immunohistochemistry techiques examined the paraffin embedded tissues of 35 cases of laryngeal papillomas.Result:showed that HPV_16/18-DNA were found in 24 cases of laryngeal papillomas(68.8%);overexpression of p53 protein were detected in 19 cases(54.3%);both of HPV_16/18-DNA and overexpression of p53 protein were demonstrated in 12 cases of laryngeal papillomas(34.3%).Conclusion:This study suggests that HPV_16/18 infection and p53 gene mutation are associated with pathogenesis of laryngeal papillomas. The relation between HPV infection and p53 mutation in tissues of laryngeal papillomas remains to be clarified.

Key wordsHuman papilloma virusLaryngeal neoplasmPapillomasp53 protein

近年来发现人乳头状瘤病毒(human papillomarvirus,HPV)感染与喉乳头状瘤及喉癌的发生有密切关系。HPV_16/18的E₆蛋白具有与p53蛋白结合并促使其降解失活^〔1〕，可能在喉乳头状瘤的发生发展过程中起重要作用。新近，我们对35例喉乳头状瘤(laryngeal papillomas,LP)中HPV_16/18行PCR检测，p53蛋白行免疫组化检测，借以探讨p53蛋白的表达及与HPV_16/18感染的关系。报告如下。

1材料和方法

1.1材料选择

收集1986～1994年的35例喉乳头状瘤组织蜡块。患者均为成年男性。

1.2检测方法

1.2.1HPV_16/18 DNA的PCR检测：切取5～8片组织于eppendorf管中，应用酚—氯仿—异丙醇DNA抽提法。PCR引物和DNA聚合酶采用Promega产品。HPV₁₆：A：5′TCAAAAGCCACTGTGTCCTG，3′；B：5′CGTGTTCTTGATGATCTGCA3′，120 dp。HPV₁₈：A：5′ACCTTAATGAAAAACGACGA3′;B：5′CGTCGTTGGAGTCGTTCCTG3′，100dP。HPV_16/18寡核苷酸探针序列为：HPV₁₆op：TGG ACC GGT CGA TGT ATG TC；HPV₁₈op:TAG CTG GGC ACT ATA GAGGC。每50 μl反应体积加入引物100 mg，DNTP 10 mol/;MgC₁₂ 20 mmol/L。模板DNA 1 μg,Ampli DNA Taq酶0.2；Buffer 10 X 1 μl，石蜡油1滴。90 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循环40次，72 ℃延伸5 min。设阳性细胞株DNA对照和去离子水阴性对照。PCR扩增产物含EB的Agrose gel中电泳，扩增的DNA在紫外光灯下，与相应阳性对照的相应碱基对出现扩增条带的为阳性。

1.2.2p53蛋白的免疫组化检测：应用抗p53基因蛋白单克隆抗体NCL-DO 7(novocastral laboratories产品)和ABC法行组织切片免疫组化染色。按ABC试剂盒方法进行(DAKO公司产品)。阳性结果判定：显微镜下阳性细胞核呈棕黄色。阳性着色范围＜30%为弱阳性(+)；30%～70%为阳性()；＞70%为强阳性()。本组将强阳性定为p53过度表达。

2结果

35例喉乳头状瘤组织中，PCR扩增后24例有HPV-DNA_16/18共同引物扩增条带(68.6%)。免疫组化染色检测p53蛋白表达，有19例强阳性(54.3%)，阳性染色主要出现在基底细胞层。HPV_16/18 DNA和染色强阳性的p53蛋白在喉乳头状瘤组织中共同表达的有12例(34.3%)。

3讨论

近年发现，HPV_16/18的E₆、E₇蛋白在致瘤过程中起关键作用，其与喉乳头状瘤的发生相关^〔1，2〕。HPV的E₆蛋白能与p53肿瘤抑制基因结合形成复合物，可加速p53蛋白的降解过程，使之抑制肿瘤细胞发生的功能失活。而Rb肿瘤抑制基因产物与HPV₁₈的E₇蛋白结合成为一个复合体，使Rb蛋白不能与特定的内源蛋白结合，从而使磷酸化受阻，导致细胞周期失控，使细胞增殖和分裂加速^〔3〕。

本文35例喉乳头状瘤中，24例检出HPV_16/18 DNA，19例有p53蛋白过度表达，而在12例中同时有HPV_16/18 DNA和染色强阳性p53蛋白的表达。提示HPV_16/18与喉乳头状瘤的发生有密切关系。有关喉乳头状瘤HPV感染状况与p53变异相互关系研究不多，谢民强等^〔4〕在13例喉鳞癌中检出3例HPV₁₆的DNA，其中2例p53蛋白过度表达；而秦兆冰等^〔5〕在44例喉鳞癌组织检出19例HPV_16/18阳性，其中12例同时有p53蛋白过度表达，二者均认为HPV感染与p53基因变异有协同致癌作用。而喉乳头状瘤是一种易复发和具有恶变趋向的肿瘤，HPV的持续感染同样在喉乳头状瘤的发生中起重要作用，是促其恶变的相关致病因素之一。Luzer等^〔6〕从24例喉乳头状瘤组织中检出23例HPV_6/11的DNA，23例p53蛋白过度表达，认为HPV的感染与p53基因变异协同是其发生不可缺少的作用。也有人认为，这两种因素在肿瘤发生中单独起作用，因为p53蛋白过表达在HPV感染阴性的肿瘤和癌细胞系中较常见，而在HPV感染阳性的肿瘤中很少见。这是由于HPV感染阴性的细胞主要是通过HPV_16/18编码的E₆蛋白与野生型p53蛋白结合，促进p53蛋白降解的途径而促进肿瘤发生，因此检测不出p53蛋白的表达^〔1，7〕。赵舒薇等^〔8〕分别检测了HPV-DNA在从正常喉组织→声带息肉→喉癌前病变组织(包括成人喉乳头状瘤4例)→喉癌，发现HPV感染率表现呈逐渐顺序升高的过程，表明了HPV感染与喉部肿瘤的发生与恶变密切相关。

我们的研究表明，HPV_16/18的感染与喉乳头状瘤的p53基因变异，在其致病因素中有较明显的内在联系，但其分子机理有待于阐明，两者的相互内在关系及其协同机理有待于深入研究。

参考文献

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8，赵舒薇，陆书昌，费声重.用聚合酶链反应技术制备地高辛标记核酸探针检测国人喉癌人乳头瘤病毒DNA.临床耳鼻咽喉科杂志，1998，12：153～156

(收稿 1999-05-05修回 2000-02-08)