关键词： 无综合征耳聋；线粒体DNA；DNA突变分析

摘要：目的：分析4个无综合征耳聋家系是否存在线粒体DNA1555^A→G的突变。方法：以PCR-RFLP方法进行线粒体DNA1555^A→G突变筛查。结果：仅1个无综合征耳聋家系中的5个成员有4个存在该突变。结论：线粒体DNA1555^A→G点突变与部分无综合征耳聋有一定关系。

Nonsyndromic deafness and mitochondrial DNA mutation

LIU Yu-heKE Xiao-meiGU Zhi-ping

(First Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100034)

Abstract：Objective：To analysis whether there is any mtDNA 1555^A→G homoplasmic point mutation among familial nonsyndromic deafness.Method：Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) were used to screen the mutation 1555^A→G among four nonsyndromic deafness families.Result：The same mutations were checked out in 4 of 5 individuals in 1 of 4 families.Conclusion：The 1555^A→G change on mtDNA might be one of the multiple genetic defects and pathogenetic of familial nonsyndromic deafness.

Key words：Nonsyndromic deafnessMitochondrial DNADNA mutational analysis▲

线粒体基因组(mtDNA)为母系遗传。近年来的研究表明mtDNA1555^A→G的同质性点突变是氨基糖甙类抗生素致聋(AAID)的分子生物学基础，但该突变并不是AAID的唯一原因^〔1〕，也不是此类耳聋所特有的突变^〔2，3〕。为进一步了解该突变在母系遗传的无综合征耳聋中的作用，以探讨无综合征耳聋发病机制，为今后建立相应的基因诊断提供依据，我们对4个无综合征耳聋家系，在首先排除了4个家系间存在遗传异质性后进行了mtDNA1555^A→G突变分析。

1资料与方法

1.1临床资料

4个先证者均为我科门诊患者，分别对其家系进行调查。并对部分家系成员进行纯音测听。选择各家系某一代中的患者用发病年龄及言语平均听力的双耳平均值为指标，采用哈尔滨医科大学数学教研室提供的PPAP软件进行用于遗传异质性检验的秩和检验。

1.2mtDNA 1555^A→G突变分析方法

DNA提取：取2～5 ml抗凝外周血，蛋白酶K-盐析法提取DNA。

PCR：引物分别为：mtDNA1525～1549∶5′CTAAAACCCCTACGCATTTATATAG3′ mtDN-

A1624～1601∶5′ GCTTTGTGTTAAGCTACACT

CTGG3′由北京Cybersyn公司合成。反应体积20 μl，含50 ngDNA，70 pmole引物，250 uMdNTP，50 mM KCl，10 mM Tris-HCl pH 8.8，15 mM MgCl₂，0.1% TritonX-100，1 u Taq DNA聚合酶，在PE-Cetus 2400热循环仪上94℃5 min热变性后，94℃ 30 s-58℃ 30 s-72℃ 30 s，循环30次，接72℃延长10 min。产物100 bp，2%琼脂糖凝胶电泳检测。

限制性内切酶酶解及电泳：ALW26I (BsmAI同功酶)5 u于10 μl反应体系中酶解PCR产物4 μl，37℃保温过夜，野生型的酶解产物为80 bp和20 bp，当1555位点发生A→G突变后该酶切位点消失。每例的酶解产物和PCR产物相邻排列以8%聚丙烯酰胺凝胶(Acry∶Bis=19∶1，20 cm×20 cm)于室温下200 V电泳2～3 h。凝胶用银染显色，乙酸固定，乙醇脱水后用吸水玻璃纸包裹干燥保存。

1.3家系调查分析

家系1(图1)，可以看出其耳聋遗传方式表现为母系遗传。先证者，44岁，双耳言语平均听力(PTA)42 dB。家系1中，第Ⅱ代患者8例，本文仅统计4例，其发病年龄分别为20，37，40，20岁，PTA分别为36.5，44，43.5，42 dB。

图1无综合征耳聋家系1

家系2(图2a)，目前其耳聋遗传方式表现尚不能确定。先证者，31岁，PTA 75 dB。家系中，第Ⅲ代患者2例，发病年龄分别为5，1岁，PTA分别为37.5，80 dB。

图2a：无综合征耳聋家系2

b： 家系2 PCR-RFLP结果

家系3(图3a)，耳聋的遗传方式为非典型的母系遗传方式。先证者，5岁，PTA 75 dB。家系中，第Ⅱ代患者4例，本文仅统计3例，其发病年龄分别为15，11，18岁，PTA分别为75，58.5，85 dB。

图3a：无综合征耳聋家系3

b：家系3 PCR-RFLP结果

家系4(图4)，目前其耳聋遗传方式表现尚不能确定。先证者，13岁，PTA35 dB。家系中，第Ⅱ代患者3例，发病年龄分别为25，29，21岁，PTA分别为50，65，40 dB。

图4无综合征耳聋家系4

以上各家系耳聋患者均为迟发性进行性耳聋，且均无使用氨基甙类抗生素史。对四个家系进行的遗传异质性检验秩和检验和卡方检验结果：按发病年龄P＞0.01；按严重程度(PTA)P＞0.01。说明四个家系间不存在遗传异质性。

2PCR-RFLP结果

家系1，2，4(如图2b)：mtDNA PCR扩增产物均完全被限制性内切酶ALW26I酶解，说明未发生mtDNA1555^A→G点突变。

家系3(图3b)：在作DNA分析的5例中，除Ⅱ-2(Ⅱ-1的丈夫，无耳聋)外，4例家系成员的mtDNA PCR产物均不能被ALW26I酶解，说明均产生1555^A→G的同质性点突变。

3讨论

1993年Prezant等首先报道了家族性AAID患者存在mtDNA1555^A→G同质性点突变^〔4〕。我们也曾报道过9个AAID家系中有5个家系存在mtDNA1555^A→G同质性点突变^〔1〕。到目前为止，已发现mtDNA1555^A→G同质性点突变也存在于家族性和散发的无综合征耳聋患者中^〔2，3〕。1997年Schahawi等报道母系遗传家族性无综合征耳聋存在mtDNA1555^A→G异质性点突变^〔5〕。本研究，4个家系中有1个家系存在mtDNA1555^A→G同质性点突变。

与mtDNA1555^A→G点突变有关的耳聋表型呈异质性，包括先天性耳聋，迟发性进行性耳聋，突发性耳聋；也可以是突变基因携带者，应用氨基甙类抗生素可致聋，是高危人群。本组家系3的耳聋患者均在出生后一定年龄发病，听力渐进下降，其中Ⅱ-1存在mtDNA1555^A→G突变没发病，是高危人群。

目前已证实mtDNA1555^A→G点突变为AAID的致病突变，不受核基因的影响^〔4，6〕。机制是突变点位于12SrRNA基因的高度保守区，此位点突变使核糖体RNA螺旋结构基底部出现一对新互补碱基，使rRNA空间体积缩小，利于氨基甙类抗生素与rRNA结合，从而抑制人线粒体蛋白质合成。

大量文献支持这样的观点^〔6～8〕：mtDNA1555^A→G点突变也是无综合征耳聋的致病突变，其表型受核基因的影响。Guan等^〔6〕通过实验研究支持核基因影响了mtDNA1555^A→G突变的表型；最近，Bykhovskaya等^〔8〕进一步证实mtDNA1555^A→G的表型依赖于多个核基因的相互作用。本组家系3中Ⅱ-1虽然存在mtDNA1555^A→G突变，但并没发病，也支持了mtDNA1555^A→G的点突变，其表型受环境或核基因的影响，不可能在无综合征耳聋的发病中单独发挥作用。mtDNA1555^A→G突变可能伴随常染色体隐性突变，使线粒体转录系统发生组织特异性损伤，减少了耳蜗ATP的产生，使耳蜗功能衰竭而致聋^〔9〕。

无综合征耳聋的遗传方式各异。据估计80%的遗传性无综合征耳聋由常染色体隐性缺陷所致，18%由常染色体显性突变引起，2%由线粒体基因或X-染色体基因突变所致^〔10〕。本组家系3，从家系分析结果看，属非典型的母系遗传。目前已报道的无综合征耳聋mtDNA突变(母系遗传)包括：1555^A→G，7445^A→G和7472^insC三种^〔10〕。其中1555^A→G突变发生率最高，且该突变又是AAID的致病突变，因此在母系遗传的无综合征耳聋中，加强对mtDNA1555^A→G突变筛查，将更有临床意义。■

参考文献