Katsuki和Covell(1953)首次用机械分离法从豚鼠耳蜗中分离出有活性的外毛细胞。Zenner等和Brownell等(1985)完善和发展了毛细胞分离技术，并被广泛采用。Brewnell等先用木瓜蛋白酶加机械分离，后来仅用钝性分离和单纯吹打法。Zenner等用尖端直径为4～40 μm的玻璃毛细管通过显微操纵器，插入Corti隧道直接分离毛细胞。现将我们用的一种新的毛细胞分离方法——耳蜗灌注法，介绍如下。

1材料和方法

选用耳廓反射正常的白化豚鼠7只，体重200～300 g，雌雄兼用。培养液为平衡盐溶液，配方如下：NaCl 140 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，HEPES 5.0 mmol/L，右旋葡萄糖5.0 mmol/L。使用前用1N NaOH将pH调至7.2～7.4，用4 M NaCl将渗透压调至300 mmol/L。

将豚鼠断头，立即取出双侧听泡，打开听泡，充分暴露耳蜗。开放卵圆窗和蜗尖，用尖端套有橡皮管的普通玻璃吸管吸取约1.5 ml平衡盐溶液，套于蜗尖用力灌注，反复数次，毛细胞脱落于灌注液中，将接在培养皿中含有毛细胞的灌出液移至带样品槽的载玻片上(样品槽为圆管状有机玻璃，用强力胶粘在载玻片上)，在室温14℃～16℃下，放在湿盒内培养。在灌注分离后的1 h和6 h，在Nikon倒置相差显微镜下，对短期培养的毛细胞进行观察计数并摄影。在6 h时用1%中性红染色，确定毛细胞存活，存活细胞细胞核被染成红色。

2结果

2.1细胞形态

豚鼠耳蜗单离外毛细胞总的来说呈试管状(图1)，细胞核位于底部，中性红染色的活细胞核为红色。从顶回到底回，外毛细胞从长到短，长者70～80 μm，短者＜30 μm。绝大多数外毛细胞表皮板成一定的斜位，有少部分外毛细胞其表皮板与细胞长轴则近乎垂直，呈束状的静纤毛从表皮板中部伸出。小于30 μm的毛细胞，在细胞核处的膨大情况特别多见。纤毛则沿表皮板呈放射状排列，使得在核区膨大的底回外毛细胞状如“乌贼”(图2)。

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2.2单离毛细胞数目及存活情况

豚鼠7只(7耳)，平均每耳分离出长于30 μm的外毛细胞173(116～339)个，小于30 μm的毛细胞130(50～447)个。另外有未分开，呈簇状的外毛细胞，每耳约分出几簇至十余簇，每簇含外毛细胞几个到十余个。

在室温下培养6 h时，小于30 μm的毛细胞每耳平均存活数仍为103(20～296)个，大于30 μm的外毛细胞，每耳平均存活数123(58～336)个。

2.3单离毛细胞的变性损伤和死亡

细胞的损伤主要表现为分离时毛细胞顶部的表皮板脱落(图3)，有时可见脱落的表皮板，呈片状，其上的“V”形纤毛排列清晰可见。另外还可见到细胞扭曲现象(图3)，但这些情况主要发生在较长的外毛细胞中，在较短的底回外毛细胞还未见此现象。

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死亡毛细胞形态有两种情况，由细胞变性过度到死亡的胞体扭曲变形(图4)，分离后即死亡的胞体形态无明显异常，仅胞核不被中性红染色(图5)，但这种情况较少见，本实验中仅观察到3个这样的外毛细胞。

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3讨论

毛细胞分离方法主要有单纯机械分离法和酶消化机械分离法。用酶消化后可损伤灭活细胞表面的蛋白，用机械分离，特别是用微电极机械分离可避免酶对细胞膜蛋白的消化，保持细胞膜的完整。

我们采用非酶解的耳蜗灌注法分离毛细胞，简单易行，从处死动物到分离出毛细胞，整个过程不超过15 min，并可获得大量外毛细胞。

上皮细胞主要以一种紧密连接的方式连在一起，这种连接的完整性依赖于Ca²⁺、Mg²⁺的存在。在无Ca²⁺、Mg²⁺时或加入Ca²⁺、Mg²⁺螯合剂能破坏这种连接方式，使细胞容易离散。在实验中我们体会到不含Ca²⁺、Mg²⁺的灌注液更易分离出毛细胞，可增加单离毛细胞的数量。

迄今为止，所有分离毛细胞的方法无一不是去除耳蜗骨壁后，直接接触基底膜或将基底膜取下后再行毛细胞分离。这样做往往只能分离出顶回或接近顶回的细胞间连接比较松散的毛细胞，而底回的毛细胞则很少或很难分离出，所以，以往用于作形态、生理、生化、药理等研究的单离毛细胞几乎都是顶回的或接近顶回的外毛细胞，底回外毛细胞由于很难分离出而很少研究。本实验用灌注法分离出了大量的小于30 μm的毛细胞，细胞形态与前庭细胞明显不同，而与文献中Dulon等报道的底回毛细胞又有显著差别，如能进一步作实验确定该细胞为底回外毛细胞，将有可能为毛细胞的研究提供一个新的模型。

实验中我们观察到有一定数量的顶回或接近顶回的外毛细胞表皮板已脱落并可看到脱落呈片状的表皮板，而小于30 μm的毛细胞很少见到这种现象，这可能与细胞侧膜的强度及水流的冲击力有关，减少反复冲洗的次数可减少这样的损伤。■

(收稿 1999-04-23)