摘要：目的：分离豚鼠内耳活性良好的单离Deiters细胞，观察其形态；探讨该细胞的基本电生理特性。方法：采用酶孵育加机械分离法分离Deiters细胞；利用膜电钳技术在全细胞模式下检测全细胞电容，记录在正常外液中的钾电流，零电流电位，反转电位，并根据相应公式计算离子通道K⁺与Na⁺的相对通透性比率(P_K/P_Na)及K⁺平衡电位(E_K)。结果：单离Deiters细胞多呈逗点状，分为胞体，细柄和指突三部分，核靠近胞体中央，平均长度为(61.6±20)μM(n=45)。平均全细胞电容为(27.5±9.2)pF(n=28)，零电流电位(-20±1.8)mV(n=28)，反转电位平均为(-64.3±2.9)mV(n=24)，P_K/P_Na=25.4∶1，E_K=-84.2 mV。记录出Deiters细胞在正常外液中的钾电流。结论：根据Deiters细胞的长度可以间接推断其在耳蜗中的位置，Deiters细胞离子通道具有高K⁺选择性，其钾电流具有外向整流性和电压依赖性。

Morphological observation and electrophysiological properties

of isolated Deiters′cells from guinea pig cochlea

YANG JunWANG Ji-bao

(Department of Otorhinolaryngology，Union Hospital of Tongji Medical University,

Wuhan 430022)

Abstract：Objective：To dissociate viable isolated Deiters′ cells from guinea pig cochlea and perform morphological measurements under inverted microscope;To study electrophysiological properties of Deiters′ cells.Method：Deiters′ cells were dissociated from guinea pig cochlea by papain digestion followed by trituration.Standard patch clamp methods were used to measure whole cell capacitance,zero current potential,reversal potential and potassium ion currents of Deiters′ cells in normal external solution.Equations were used to compute the relative membrane permeability ratio of Deiters′ cell to K⁺ and Na⁺ (P_K/P_Na) and the potassium equilibrium potential (E_K).Result：Isolated Deiters′ cell looks like a comma,which was divided into cell body,stem and Deiters′ phalanx and the nucleus is at about center of its body.Cell length of Deiters′ cells was (61.6±20) μM (mean±SEM,n=45),whole cell capacitance was (27.5±9.2)pF(n=28),zero cunrent potential was (-20±1.8)mV(n=28),reversal potential was (-64.3±2.9)mV(n=24),P_K/P_Na=25.4∶1 and E_K=-82.4mV.Potassium currents of Deiters′ cells were recorded in normal external solution.Conclusion：The situation of Deiters′ cells in cochlea could be infered according to length of them indirectly.The ion channel of Deiters′ cells was mainly K⁺ selective.Voltage-dependent and outwardly rectifying potassium currents were prominent in Deiters′ cells.

Key words：Deiters′ cellsStandard patch clamp methodElectrophysiologyPotassium currents▲

Deiters细胞是哺乳动物Corti′s器中的一种支持细胞，与外毛细胞(OHC)的关系非常密切，过去认为，它仅具有对OHC的机械支持作用。晚近的形态学和电生理研究表明，Deiters细胞与传出神经，可能还与传入神经纤维构成突触联系^〔1〕，其细胞内部独特的超微结构以及电生理学反应对于耳蜗功能的维持非常重要。本文采用酶消化加机械分离法获得了活性良好的单离Deiters细胞，在倒置显微镜下对其形态进行了观察，并应用膜电钳技术研究其基本的电生理特性，报道如下。

1材料和方法

1.1细胞分离和形态学观察

选用250～300 g的杂色或白色preyer反射阳性的健康豚鼠25只(同济医科大学实验动物中心)，雌雄不拘。采用与耳蜗OHC相同的分离方法^〔2〕，分离出的基底膜组织在含0.25 g/L木瓜蛋白酶的正常细胞外液中消化10～12 min(20℃)，在牛血清白蛋白(0.5 g/L)中孵育10 min以上。在倒置显微镜下观察Deiters细胞的形态并测量细胞长度。用于电生理试验的细胞均为单离者，以消除邻近细胞通过细胞间的缝隙连接对记录结果产生的影响。

1.2溶液与试剂

正常细胞外液(mmol/L)：NaCl 150，KCl 5，CaCl₂ 2，MgCl₂ 1，HEPES 10，Glucouse 10。用1 mol/L的NaOH调节pH至7.4，渗透压为(300±2)mOsm/kgH₂O，用前经95%O₂加5%CO₂混和气体饱和。电极内液(mmol/L)：KCl 140，CaCl₂ 0.5，MgCl₂ 5，HEPES 10，EGTA 5，Na₂ATP 5，用1 mol/L的KOH调节pH至7.2，渗透压为(290±2)mOsm/kgH₂O。木瓜蛋白酶和牛血清蛋白分别为德国Merk公司和美国Sigma公司产品。

1.3电生理试验

膜电钳放大器(华中理工大学，PC-Ⅱ型)通过12位A/D和D/A数据转换器(华中理工大学DA-Ⅰ型)同计算机相连接。刺激信号及电压输入信号的采集均由软件P-6(华中理工大学)控制。玻璃毛坯(中科院上海生理所，GG-17)用微电极拉制仪(Narishige，PP-83，日本)二步拉制成尖端为1～1.5 μm的电极，充灌电极内液，入水后电阻为3～5 MΩ。补偿液接电位，调节三维操纵器(Narishige,MN3和MO-203，日本)使电极尖端移向细胞表面进行封接，封接电阻达1 GΩ以上。补偿快电容并吸破细胞膜形成全细胞记录模式。施以0.4 V/s的斜坡刺激进行电容测定。调节慢电容补偿和串联电阻补偿(50%～80%)以减少瞬时充放电电流和钳位误差。记录Deiters细胞在正常细胞外液中的钾电流。将膜电钳放大器的记录模式转换为“CC+comm”档，记录在电流钳下的零电流电位。在全细胞模式下记录细胞的反转电位(E_rev)，根据公式①计算出Deiters细胞离子通道K⁺对Na⁺的相对通透性比率(P_K/P_Na)。

①

式中［K］o，i，［Na］o，i分别代表细胞外液和电极内液中K⁺和Na⁺浓度。根据公式②计算K⁺平衡电位(E_K)。

E_K=(RT/F)×In(［K］o/［K］i)②

采样后数据存贮在硬盘内，供测量。结果用±s表示。所有试验均在室温(20℃)下进行。

2结果

活性良好的单离Deiters细胞在光镜下无可见的细胞器活动，细胞内无布朗运动，呈正常的充盈状态。符合上述标准的单离Deiters细胞多呈倒立的逗点状(见图1)，有胞体，细柄和指突。胞体较大，核清晰可见，靠近体部中央，胞体顶端伸出杵状的指突；指突下方与胞体连接处较细，称细柄。在镜下常可见Deiters细胞以指突与OHC的表皮板侧缘相连。Deiters细胞的平均长度为(61.6±20)μm(n=45)。最短者25 μm，最长者125 μm。图2A示一个典型的Deiters细胞在正常细胞外液中的钾电流。图2B为根据记录的钾电流绘出的I/V曲线(n=28)。平均全细胞电容为(27.5±9.2)pF(n=28)，零电流电位(-20±1.8)mV(n=28)，反转电位平均为(-64.3±2.9)mV(n=24)，根据公式①计算出的P_K/P_Na为25.4∶1，根据公式②计算出E_K=-84.2 mV。

图1豚鼠单离Deiters细胞的形态×640

图2Deiters细胞的外向整流电流A：一个典型细胞的外向电流；

B： 外向电流的I/V曲线(n=28)，电流值取自阶跃电压结束前1 ms(迟电流)

3讨论

关于单离Deiters细胞形态及其基本的电生理活动，国内鲜见报道。在大多数哺乳动物的耳蜗中，Deiters细胞呈3排平行排列，与OHC相对应。每个Deiters细胞胞体的底部锚定于基底膜，其胞体的表面(即逗点的弯曲侧)承载OHC，顶端指突则构成网状层的一部分。在同一耳蜗中，Deiters细胞的长度并不一致，本实验观察到的Deiters细胞最短者25 μm，最长者125 μm。平均长度(61.6±20)μm(n=45)。细胞长度的差异可能与其在耳蜗中所处的位置不同有关。从蜗底到蜗顶Deiters细胞长度逐渐增加，与OHC长度变化的趋势一致，较短的细胞靠近蜗底，较长的细胞靠近蜗顶。Samuel等^〔3〕研究了蒙古沙土鼠耳蜗Deiters细胞的超微结构，发现胞浆中具有独特的玫瑰花形复合体。复合体的核心为致密纤<