关键词： 促生长素；细胞活素类(细胞因子)；萤光素 酶；Pit-1基因

【摘要】目的研究人促生长素释 放激素(hSRH)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏 死因子-α(TNF-α)对垂体前叶促生长素细胞中促生长素基因表达的调控作用及其与Pit- 1的关系。方法将含有人促生长素基因启动子和萤光 素酶报告基因的融合基因表达质粒(pGL₂-GH-Luc)单独转染或与人Pit-1基因表达质粒( PcDNA-Pit-1cDNA)共转染于大鼠GH₃细胞中，体外观察hSRH、IL-1β、IL-6和TNF-α 对萤光素酶表达的影响，以反映融合基因中人促生长素基因启动子的活性。结果(1)单独转染pGL₂-GH-Luc质粒时，hSRH(10^-9～10 -7 mol/L)并不影响萤光素酶表达，与PcDNA-Pit-1cDNA-质粒共转染后，hSRH(10 -8 mol/L及10^-7 mol/L)明显促进萤光素酶表达至1.68倍，而Pit-1基因反义寡 聚核苷酸又可阻断hSRH的作用。(2)单独转染pGL₂-GH-Luc质粒时，IL-1β(10～1000 U/ml)或IL-6(100～10000 U/ml)均明显促进 萤光素酶的表达，分别至对照的2.04和2.59倍，并依赖剂量，同时转染PcDNA-Pit -1cDNA质粒时，Pit-1蛋白和IL-1β或IL-6对萤光素酶表达的促进作用可以叠加。(3)TN F-α(100～10000 U/ml)可明显抑制萤光素酶表达至对照的0.58倍，也呈 剂量依赖型。结论hSRH促进人促生长素基因表达必 须通过人Pit-1蛋白介导。IL-1β和IL-6显著促进垂体人促生长素基因表达，而TNF-α 明显抑制垂体人促生长素基因表达。

The effects of somatotropin-releasing hormone and c ytokines on pituitary somatotropin gene expression and their relationship with P it-1

WANG Zhi,DENG JieyingSHI Yifan

（Department of Endocrinology, PUMC Hospital,Beijing 100730）

【Abstract】ObjectiveTo investigat e the roles of human somatotropin-releasing hormone (hSRH), interleukin-1β (I L-1β) , interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) on somatotropin gene expression and their relationship with pituitary specific transcription fa ctor--Pit-1 in somatotropin gene expression regulation. Metho d sThe plasmid pGL₂-GH-Luc with fusion gene expression conta ining the promoter of human somatotropin gene and luciferase reporter gene was transfected alone or cotransfected with human Pit-1 expression plasmid PcDNA-P it-1cDNA into rat GH₃ cells, and then hSRH, IL-1β, IL-6 and TNF-α were a dded to the culture medium to evaluate their effects on luciferase expression in order to reflect human somatotropin gene promoter activity in the fusion gene. Results(1)When plasmid pGL₂-GH-Luc was tra nsfected alone, hSRH (10^-9～10^-7 mol/L) had no effect on luciferase expression in the absense of human Pit-1. During cotransfection with plasmid Pc DNA-Pit-1cDNA, hSRH (10^-8～10^-7 mol/L) caused a significant stimul a tion of luciferase expression in a dose-dependent manner up to 1.68 fold of the control, stimulation of luciferase expression with hSRH was blocked by Pit-1 O ND. (2)When plasmid pGL₂-GH-Luc was transfected alone, IL-1β (10～1000 U/ml)or IL-6 (100～10000 U/ ml)caused a pronounced dose-dependent stimulation of luciferase expression up to 2.04 and 2.59 fold respectively. During cotransfection with plasmid PcDNA-Pi t-1cDNA, an additive effect of I L-1β or IL-6 with Pit-1 on luciferase expression was seen. (3)TNF-α (100～ 10000 U/ml) induced a pronounced dose-dependent inhibition of l uciferase expression, down to 0.58 fold of the control. Conclus ionhSRH regulates human somatotropin gene transcription onl y at the presence of human Pit-1. The expression of human somatotropin in the a nterior pituitary can be promoted by IL-1β or IL-6 and inhibited by TNF-α.

【Key words】Somatotropin; Cytokines; Luciferase; Pi t-1 gene

垂体促生长素基因表达主要受促生长素释放激素(SRH)调 节，而S RH促进促生长素基因表达时必须由垂体特异转录因子Pit-1蛋白介导。近期的研究还表明， 促生长素与免疫系统的关系很密切，细胞因子对垂体促生长素分泌也有调节作用，其中研究 比较多的是白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF- α)，他们分别兴奋或抑制促生长素分泌^〔1-5〕。本研究利用人促生长素基因启动 子 与萤光素酶报告基因构建的融合基因转染大鼠GH₃细胞，研究人SRH(hSRH)及细胞因子对 垂体促生长素基因表达的调控作用，并同时探讨Pit-1蛋白在垂体促生长素基因表达调控中 所起的作用，并探讨垂体促生长素基因表达调控的机制。

材料和方法

一、材料

大鼠垂体分泌促生长素及催乳素(PRL)的GH₃细胞株，购自美国ATCC公司。无血清DMEM培养 液(补充了GIBCO公司的非必需氨基酸溶液和胰岛素-转铁蛋白-硒化钠溶液)。阳离子脂质 体(lipofectamine)购自GIBCO公司。萤光素酶和β半乳糖苷酶测定试剂盒均购自Promega 公司。hSRH为德国Bissendorf Peptide公司赠送，人IL-1β、人IL-6和人TNF-α均系邦 定公司产品。

pGL₂-Basic为阴性对照质粒，含有萤光素酶编码基因，无真核启动子和增强子；pGL₂ -Promoter为阳性对照质粒，含有萤光素酶编码基因和腺病毒SV40启动子；pSV-β-gal为 内参照质粒，含有β-半乳糖苷酶编码基因和腺病毒SV40早期启动子和增强子；pGL₂-GH -Luc是本实验中使用的一种主要质粒，含有萤光素酶编码基因和人促生长素基因启动子-4 80 bp～+2 bp序列的融合基因；PcDNA-Pit-1cDNA为Pit-1表达质粒，含有人Pit-1基因 编码序列和巨细胞病毒(CMV)启动子，上述质粒均为本室保存。Pit-1基因反义寡聚核苷酸( Pit-1 OND)，可以特异地结合于Pit-1基因翻译起始位点，抑制Pit-1蛋白合成，序列为G AAAGGTTGGCAACTCAT-TCCCAC^〔6〕，由赛百盛公司合成。

二、方法

1.脂质体转染质粒方法：将GH₃细胞以2×10⁵/孔接种于六孔培养板中，待GH₃细胞完 全贴壁生长并长至培养孔板底面积的50%～80%后，换新鲜的无血清DMEM培养液3 ml，继续培 养3 小时，洗涤细胞两次，每孔加入0.8 ml DMEM培养液。同时准备两支无菌的1.5 ml Eppendof f管，一管配备转染质粒(pGL₂-GH-Luc或pGL₂-GH-Luc+PcDNA-Pi t-1cDNA质粒液) ，加入DMEM培养液0.1 ml，质粒1 μg及内参照β-半乳糖苷酶质粒0.8 μg。另一管配备转 染试剂，加入DMEM培养液0.1 ml及阳离子脂质体4 μl。小心混合两管液体，置35℃水浴孵 育45分钟，立即加于GH₃细胞生长的六孔板中，每孔加0.2 ml，细胞继续培养。

2.Pit-1 OND转染方法：Pit-1 OND是人Pit-1蛋白合成的特异抑制剂，其转染方法与质粒 转染方法相同。

3.实验：质粒向GH₃细胞中转染4小时后，更换无血清DMEM培养液3 ml，继续培养34小时， 再次用无血清DMEM培养液3 ml换液，然后分别加入不同浓度的hSRH、IL-1β、IL-6和TNF -α，继续培养2小时。取出GH₃细胞测量萤光素酶和半乳糖苷酶活性。每种实验均重复3 次。

4.酶活性测定：(1)裂解GH₃细胞：用磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次，加入250 μl报告基因 裂解缓冲液覆盖全部细胞，然后刮下细胞，移入1.5 ml Eppendoff管，12 000 g离心2分钟，上清即为GH₃细胞裂解液，储存于-70℃待测定酶活性。(2)萤光素酶活 性测定：取20 μl GH₃细胞的裂解液与100 μl萤光素酶反应底物混合，立即检测发光值 ，检测时间为15秒，每个标本重复测定3次，计算每孔标本的平均发光值，以发光值的高低 反映萤光素酶活性。(3)β-半乳糖苷酶活性检测，按照说明书进行。

5.结果计算及统计学处理：观察hSRH及细胞因子对GH₃细胞中萤光素酶表达的影响时，将 测得的平均发光值用同一标本的β-gal活性进行校正即得到该孔的萤光素酶活性。将样品 的萤光素酶活性用对照孔校正后即得到相对荧光素酶活性。组间比较用t检 验进行统计学分析。

结果

一、hSRH对转染pGL₂-GH-Luc质粒的大鼠垂体GH₃细胞中萤光素酶表达的影响

在单独转染pGL₂-GH-Luc质粒的大鼠垂体GH₃细胞中，浓度为10^-9～10^-7 mol/L的hSRH均不影响萤光素酶的表达(P均＞0.3)。PcDNA-Pit-1cDNA与 pGL₂-GH-Luc质粒共转染GH₃细胞后，10^-9 mol/L的hSRH对GH₃细胞中的萤光 素酶表达无影响(P＞0.05)，而浓度为10^-8及10^-7