Graves病(GD)属常见的自身免疫病之一。在免疫应答 中 ，T细胞受体(TCR)是T细胞识别外来抗原和细胞表面组织相容性抗原(MHC)的、有双重识别作 用的 主要功能单位。TCR每条链上的可变区(Ⅴ区)具有识别抗原、决定TCR的抗原特异性的功能。 近年来通过甲状腺TCR Ⅴ基因的表达寻找T细胞克隆的受限，已作为研究GD病因途径 ^〔1〕。本研究应用RT-PCR技术检测GD患者甲状腺、外周血淋巴细胞TCR Ⅴ_α1-1 8基因族的表达。

一、材料与方法

1.对象：(1)GD患者5例，男2，女3，年龄30～46岁。术前服碘2周。每例患者手术中切除 甲状腺组织的同时采肘静脉血10 ml并抗凝。(2)健康对照者5例，男2，女3，年龄25～3 8岁。采肘静脉血10 ml并抗凝。对照者无GD及其他自身免疫病史。

2.外周血单核细胞(PBMC)分离：抗凝血10 ml用Hanks液稀 释，以密度梯度离心分离单核细胞，-80℃保存。

3.甲状腺标本的处理：手术切除的甲状腺组织在30分钟内用生理盐水冲洗积血后，切成细小 组织块，-80℃保存。

4.总RNA的提取：将低温保存的甲状腺组织碎块和TRIzol于匀浆器中匀浆，把此匀浆(或低温 保存的细胞)用氯仿和酚提取法提取RNA。

5.引物的合成：引物设计参照Davies等报告^〔1〕。5’引物Ⅴ_α1-18，3’引物C _α由中国科学院上海细胞生物研究所合成。

6.RT-PCR^〔2〕：(1)cDNA第一链的合成：用从甲状腺组织(或PBMC)提取的总RNA与引 物制备RNA/引物混合物。此混合物与反应体系反应(dNTP、DTT、MgCl₂，10×PCR缓冲液) 在鼠源SuperscriptⅡ逆转录酶作用下反向合成cDNA。(2)TCRⅤ_α基因的扩增：反应 体系含模板cDNA，5’及3’端引物，Taq DNA多聚酶。dNTP及含MgCl₂缓冲液。每一反应体 系加一对引物，18组反应体系同时PCR扩增。取各扩增物通过琼脂糖凝胶电泳分离。

7.试剂：(1)RT-PCR试剂盒购自美国Gibco公司。(2)引物由上海细胞生物研究所合成。

8.统计学处理：所有实验结果用±s表示。差异显 著性用t检验。

二、结果1.GD患者PBMC的TCR Ⅴ_α基因族的表达10.4±1.7，患者P1Ⅴ_α1 、Ⅴ α3-6、Ⅴ_α9、Ⅴ_α18未表达。健康人PBMC的TCRⅤ_α基因组的表达10.8±1.3。

2.GD患者甲状腺TCR Ⅴ_α基因族的表达4.4±1.5，与PBMC相比较差异有显著性(P＜0.01)。甲状腺TCR Ⅴ_α基因族Ⅴ_α1-7、Ⅴ_α9、Ⅴ _α10、Ⅴ_α16-18未表达，甲状腺组织与自身的PBMC相比较，前者Ⅴ_α基因族表达显 著受限，其表达的基因也不完全相同，无某个基因表达占优势。

三、讨论

为探讨自身免疫性甲状腺疾病的T细胞功能，我们应用PCR技术检测GD患者甲状腺TCR Ⅴ α1-18基因族，结果显示Ⅴ_α8、Ⅴ_α11-15基因表达，与Davies等报道的结果一 致，GD患者甲状腺TCRⅤ_α基因族多数基因表达受限，正常对照者甲状腺及PBMC TCR Ⅴ α基因表达广泛^〔1，3〕。对GD基因表达的观察可见TCR Ⅴ_β基因族的表达多于Ⅴ _α基因族，Ⅴ_β基本不表现受限制。这些研究结果提示GD TCR Ⅴ_α基因的表达可能 对识别甲状腺抗原更重要。因此，Heber-Katz等提出自身免疫T细胞TCR Ⅴ_α区疾病的 假说^〔4〕。本研究结果显示TCR Ⅴ_α基因表现非一致受限，每一患者的T细胞具有 不完全相同的Ⅴ_α基因表达。其原因可能与每一个体的甲状腺细胞表面的HLA-D R类型的组织相容性抗原(MHC)不同有关^〔5〕。

遗传免疫学研究认为不受限制的多克隆反应的表达是正常免疫系统的特点。如果TCR Ⅴ基因 明显受限制可能提示免疫系统是否有缺陷。这些研究可能支持T细胞对甲状腺抗原的免疫反 应的重要性。因此，TCR Ⅴ基因表达的情况是探讨GD病因的重要途径。

基金项目：辽宁省自然科学基金资助项目(98503 40530)

参考文献

1，Davies TF, Martin A, Concepcion ES, et al. Evidence of limite d variability of antigen receptors on intrathyroidal T cell in autoimmune thyroi d disease. N Engl J Med, 1991,325:238-244.

2，钱关祥. RNA的提取纯化. 见：陈竺， 等主编， 分子生物学与疾 病. 上海：百家出版社， 1994,46-48.

3，Davies TF. Preferential use of T-cell receptor Ⅴ genes in h uman autoimmune thyroid disease. Autoimmunity, 1992,13:11-16.

4，Heber-katz E, Acha-Orbea H. The Ⅴ-region disease hypothesis: Evide nce from autoimmune encephalomyelitus. Immunol Today, 1989,10:164-169.

5，Adorini L, Guery JC, Gemma RT, et al. Selective immuno-suppression. I mmunol today, 1993,14:285-289.

(收稿日期：1998-08-14)