关键词： 胰岛素；二甲双胍；纤溶酶原激活物抑制物1；HepG2细胞

【摘要】目的观察胰岛素、胰岛素原对HepG2细胞纤维蛋白溶解酶原激活物抑制物-1(PAI-1)基因表达的影响。方法将HepG2细胞置于10^-7 mol/L胰岛素培液中24小时使胰岛素受体下调，将HepG2细胞诱导成为胰岛素抵抗的HepG2细胞，然后分别用胰岛素、胰岛素原(10^-9 mol/L)持续刺激HepG2细胞24小时，检测培养液中PAI-1的活性、含量及胞浆中PAI-1 mRNA水平。结果(1)基础状态下胰岛素抵抗和非胰岛素抵抗的HepG2细胞PAI-1活性、含量及mRNA水平差异无显著性。(2)10^-9 mol/L胰岛素或10^-9 mol/L胰岛素原刺激24小时，胰岛素抵抗的HepG2(IR-HepG2)细胞PAI-1活性、含量及mRNA水平明显高于非胰岛素抵抗的HepG2(NIR-HepG2)细胞。(3)10^-9 mol/L胰岛素和胰岛素原同时刺激24小时，胰岛素抵抗的HepG2细胞PAI-1活性、含量明显高于二者之一单独刺激。(4)10^-4 mol/L二甲双胍可明显抑制HepG2细胞PAI-1 mRNA的过度表达。结论胰岛素抵抗状态下免疫反应性胰岛素水平升高，胰岛素抵抗的HepG2细胞PAI-1合成对胰岛素刺激的反应性增强是导致PAI-1活性升高的主要原因。10^-4 mol/L二甲双胍可在mRNA水平抑制PAI-1的合成。

Expression of plasminogen activator inhibitor-1 gene by insulin resistant HepG2 cell line

LI Changgui

(Shanghai Institute of Endocrinology,Ruijin Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025)

NING Guang

(Shanghai Institute of Endocrinology,Ruijin Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025)

CHEN Jialun.

(Shanghai Institute of Endocrinology,Ruijin Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025)

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of insulin and proinsulin on the expression of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI_1) gene by HepG2 cell line.MethodsHepG2 cells were induced to a status of insulin resistance (IR) by being exposed to 10^-7 mol/L insulin for 24 hours. Then the levels of PAI_1 activity, concentration and mRNA from HepG2 cells were evaluated after insulin and proinsulin (10^-9 mol/L) stimulation.Results(1)The levels of PAI_1 activity, concentration and mRNA from IR-HepG2 cell were not significantly different than those from non-insulin resistance (NIR)-HepG2 cell under basal status. (2)The levels of PAI-1 activity, concentration and mRNA from IR-HepG2 cell were significantly higher than those from NIR-HepG2 cell after insulin or proinsulin (10^-9 mol/L) stimulation for 24 hours. (3)The levels of PAI-1 activity, concentration and mRNA from IR-HepG2 cell were significantly higher after stimulated by insulin and proinsulin (10^-9 mol/L) than those by insulin or proinsulin (10^-9 mol/L) alone. (4)The levels of PAI-1 activity, concentration and mRNA from IR-HepG2 cell were reduced to those in NIR-HepG2 cell when 10^-4 mol/L metformin was added in media containing insulin or proinsulin.ConclusionThe increased levels of insulin and proinsulin as well as overexpression of PAI-1 gene in IR-HepG2 cell after stimulated by insulin or proinsulin are the main cause for increased PAI-1 activity. Metformin inhibits PAI-1 synthesis at the level of mRNA transcription.

【Key words】Insulin; Metformin; Plasminogen activator inhibitor 1; HepG2 cell

(Chin J Endocrinol Metab, 2000,15:239-242)

纤维蛋白溶解酶原激活物抑制物-1(PAI-1)是调节纤溶活性的重要因子，PAI-1活性增加及由此而致的纤溶活性降低是冠心病等血管栓塞性疾病的独立危险因子。肝细胞是体内PAI-1的来源之一，肝细胞PAI-1的合成受胰岛素、胰岛素原的调节，临床研究的结果显示，血浆免疫反应性胰岛素水平与PAI-1水平有明显相关性^〔1-5〕。为进一步探讨胰岛素抵抗状态下PAI-1活性升高的机制，本研究将HepG2细胞诱导成为胰岛素抵抗的HepG2细胞(IR-HepG2)，然后观察胰岛素、胰岛素原、二甲双胍对HepG2细胞PAI-1活性、含量及PAI-1 mRNA表达的影响。

材料与方法

一、材料

人胰岛素、胰岛素原购于Sigma公司。HepG2细胞株购于上海细胞生物研究所。RNA抽提试剂盒购于美国Gibco公司，PAI-1 cDNA探针为美国友人赠送。PAI-1活性试剂盒购于上海医科大学分子遗传实验室。PAI-1含量试剂盒购于法国Digo公司。

二、方法

1.细胞培养：将HepG2细胞置于25毫升塑料培养瓶中，每瓶中加入5毫升含10%小牛血清的DMEM培养液，在5%的CO₂温箱中37℃温育至呈单层贴壁细胞。弃培养液，加入5毫升含3%小牛血清白蛋白的DMEM温育24小时，弃培养液，分别用pH 4.0 DMEM和0.01 mol/L PBS洗涤5次，此为非胰岛素抵抗的HepG2细胞(NIR-HepG2)。

2.IR-HepG2的建立：参照Burant等^〔6〕的方法并加以改良：将单层贴壁HepG2细胞置于含3%小牛血清白蛋白及10^-7 mol/L胰岛素的DMEM培养液中，在5%的CO₂温箱中37℃温育24小时，弃培养液，分别用pH 4.0 DMEM和0.01 mol/L PBS洗涤5次，此为胰岛素抵抗的HepG2细胞(IR-HepG2)。

3.HepG2细胞总RNA的提取：按照RNA提取试剂盒说明书进行操作。最后用DEPC水40 μl溶解RNA沉淀，将其置于60℃水浴中温浴10分钟，取2μl稀释50倍测OD₂₆₀/OD₂₈₀比值约为1.9，将RNA浓缩后制成浓度为1.5 μg/μl的溶液，置于-20℃储存。

4.RNA电泳和转移：制备甲醛变性琼脂糖凝胶，取20 μg RNA 4 V/cm的电压电泳3小时，变性胶用DEPC水淋洗，20×SSC浸泡，将RNA转移到尼龙膜上。用6×SSC漂洗膜20分钟，用滤纸吸干后紫外照射5分钟，80℃干烤60分钟。

5.探针的制备、杂交、放射自显影：制备感受态C600菌株，将含PAI-1 cDNA片段的质粒PBR322进行转化反应，经鉴定后，进行扩增、提取、纯化，用限制性内切酶EcoR I进行酶切反应，用低熔点琼脂糖胶电泳回收技术进行目的片段的回收。选〔³²P〕-dCTP为探针标记物，应用随机引物法进行PAI-1 cDNA片段标记，比活度为10⁸ cpm/μg。尼龙膜进行预杂交后加入PAI-1 cDNA探针，70℃杂交过夜，漂洗后，在暗室中压片，置-70℃放射自显影48小时，并经显影、定影后观察杂交条带，用凝胶图像分析仪对条带进行分析。

6.PAI-1活性测定用发色底物法：PAI-1活性单位定义为：在25℃、20分钟内抑制1.0国际单位组织型纤维蛋白溶解酶活化物(t-PA)的PAI-1酶量，即为1.0 AU(Arb.Unit)。发色底物为S₂₂₅₁。测试范围：0～0.025 AU/ml批内CV为5.6%，批间CV为6.2%。PAI-1含量测定用ELISA法。批内CV为6.8%，批间CV为7.2%。

三、统计学处理

PAI-1活性和含量测定结果用±s表示，组间比较用F检验，组内比较用F检验中的两两比较。将杂交条带进行灰度扫描所得数据，用F检验进行分析。

结果

一、胰岛素及胰岛素原对HepG2细胞PAI-1水平的影响

基础状态下IR-HepG2和NIR-HepG2细胞PAI-1活性和含量差异无显著性〔(2.9±0.7 vs 2.7±0.5)AU/ml; (16.8±5.2 vs 14.5±3.6)ng/ml〕。如表1所示10^-9 mol/L胰岛素原刺激24小时IR-HepG2细胞PAI-1活性、含量明显高于NIR-HepG2细胞(P＜0.05)。当10^-4 mol/L二甲双胍同时加入培养液中后，10^-9 mol/L胰岛素原对IR-HepG2细胞PAI-1的增强刺激作用受到明显抑制。10^-9 mol/L胰岛素刺激24小时，IR-HepG2 PAI-1活性、含量明显高于NIR-HepG2细胞。当10^-4 mol/L二甲双胍同时加入培养液中后，IR-HepG2 PAI-1活性、含量与NIR-HepG2细胞差异无显著性〔(5.2±2.6 vs 4.6±1.5)AU/ml；(65.0±4.8 vs 60.0±5.6)ng/ml〕。10^-9 mol/L胰岛素和10^-9 mol/L胰岛素原同时刺激IR-HepG2细胞24小时，PAI-1活性为(15.6±3.2)AU/ml、含量为(136.0±9.2)ng/ml明显高于二者之一单独刺激，P值均＜0.05。

二、10^-9 mol/L胰岛素、10^-4 mol/L二甲双胍

表1胰岛素原、胰岛素和二甲双胍对HepG2细胞PAI-1活性、含<