雌激素在骨代谢，尤其在分解代谢中起着相当重要的作用，但有关雌激素对骨组织的确切作用机制迄今尚未完全阐明。本研究拟通过观察雌激素对体外培养小鼠胚胎长骨c-fos和c-jun表达的影响。

一、材料和方法

1.材料：雌酚酮购自浙江仙居药厂。培养基BGJ、HEPES、胎牛血清、胃蛋白酶均购自Sigma公司。兔抗人c-fos多克隆抗体和兔抗小鼠c-jun多克隆抗体(一抗)购自美国Santa Cruz公司，兔SP^TM试剂盒(含生物素化羊抗兔IgG，二抗)购自美国Zymed公司。

隔水式恒温培养箱，旋转装置，超净工作台，Olympus解剖显微镜，组织切片机，THW-500型真彩色图像分析系统。

2.方法：(1)实验分组：实验分正常对照组和加入雌酚酮浓度分别为10^-7 mol/L、10^-8 mol/L、10^-9 mol/L三个组。每组培养长骨每次6根共5次。(2)培养方法：将16天孕龄的昆明种小鼠脱颈椎处死，取雌性胎鼠尺骨置于培养瓶中，按实验分组加入待测药物，置旋转装置上，通入比例为O₂:CO₂:N₂(45%:5%:50%)的混合气体，气流量1.5 L/min，于(37.5±0.5)℃旋转培养，35转/min，24小时后补充气体一次，每次通气1分钟。(3)检测指标：①骨干及骨总长度的测量：尺骨培养48小时后，在解剖显微镜下测量其骨总长度及骨干长度。②c-fos、c-jun免疫组织化学染色：骨组织用4%甲醛固定、EDTA脱钙后，石蜡切片(5 μm)，采用SP染色法，DAB显色。③结果判定及图像分析：光镜下观察骺板静止区、增殖区和肥大区c-fos、c-jun的阳性细胞分布，切片放大倍数均为40倍，测量窗面积100 μm²，分别测定各区阳性细胞数和阳性细胞面积。

3.统计学处理：所有数据均进行方差分析和t检验。

二、结果

1.雌酚酮对骨干及骨总长的影响：培养介质中雌酚酮浓度为10^-7 mol/L时，48小时后长骨骨干(1.39±0.08)mm及总长(3.76±0.07)mm与对照组骨干(1.22±0.08)mm及总长(3.54±0.07)mm相比均显著增加(P＜0.01)，低于10^-7 mol/L时，则统计学差异无显著性(P＞0.05)。

2.雌酚酮对c-fos和c-jun蛋白质表达及分布的影响：正常对照组c-fos、c-jun免疫组织化学染色切片中，长骨骺板静止区、增殖区和肥大区均可见免疫反应阳性软骨细胞，阳性物质位于细胞核，呈棕色颗粒状。经雌酚酮处理后，各区细胞形态和阳性物质定位未发生改变，但表达程度及分布发生了变化。对照组静止区、增殖区和肥大区每100 μm²中c-fos阳性细胞面积分别为(8.15±0.18)μm²、(8.23±0.13)μm²和(7.40±0.17)μm²，阳性细胞数分别为58.3±1.5、58.7±1.6和18.4±1.3。c-jun各区阳性细胞面积分别为(12.02±0.50)μm²、(12.19±0.33)μm²和(8.20±0.62)μm²，阳性细胞数分别为51.7±4.1、37.0±2.6和18.0±2.6。当雌酚酮浓度为10^-7 mol/L时，各区阳性细胞面积均显著增大，静止区、增殖区和肥大区c-fos阳性细胞面积分别为(9.54±0.27)μm²、(13.05±0.18)μm²和(9.78±0.10)μm²，c-jun分别为(20.20±0.22)μm²、(19.27±0.31)μm²和(13.24±0.56)μm²，与对照组比较P＜0.01。增殖区和肥大区c-fos阳性细胞数分别为72±2和26±2，静止区和增殖区c-jun阳性细胞数分别为66±6和69±2，均高于对照组(P＜0.01)。浓度为10^-8 mol/L时，静止区和增殖区c-fos阳性细胞面积较对照组增大(P＜0.01)，分别为(9.37±0.17)μm²和(10.24±0.15)μm²，静止区、增殖区和肥大区c-jun阳性细胞面积均比对照组增大(P＜0.01)，分别为(17.32±0.13)μm²、(15.72±0.21)μm²和(11.5±0.28)μm²。增殖区c-jun阳性细胞数(54±4)高于对照组(P＜0.05)。浓度为10^-9 mol/L时，仅增殖区c-fos阳性细胞面积(9.57±0.21)μm²高于对照组(P＜0.01)，其余各组与对照组相比差异无显著性(P＞0.05)。

三、讨论

培养介质中加入适当浓度雌酚酮后，长骨骨干及骨总长的增长速度明显加快，此作用与文献报道雌二醇的作用一致^〔1〕。

Fos蛋白和Jun蛋白与成骨细胞^〔2-4〕和破骨细胞^〔5〕的分化、成熟及功能密切相关。在软骨内成骨过程中，c-fos高表达是软骨细胞进入细胞周期循环所必需的，c-fos表达与软骨细胞向成骨细胞分化有关^〔6〕。在培养大鼠颅骨成骨细胞中发现，在细胞增殖期和发育期，c-fos mRNA、c-jun mRNA均呈高水平转录^〔7〕。c-fos表达下降或过度表达均导致骨发育异常^〔8〕，表明c-fos的表达对正常骨发育是十分重要的。

文献报道雌激素可通过雌激素反应元件和FOS-JUN形成的AP-1转录因子调控下游基因表达^〔9〕。雌激素对软骨细胞c-fos和c-jun表达的影响尚未见文献报道，但已有文献表明雌激素能够影响软骨细胞的增殖、肥大和矿化^〔6〕，也可以快速调节破骨细胞的c-fos mRNA和c-jun mRNA水平^〔5〕，提示雌激素对骨及软骨发育的影响很可能与其对骨组织c-fos和c-jun表达的影响有关。本研究实验结果表明雌酚酮在体外能不同程度地上调长骨骺板软骨静止区、增殖区和肥大区c-fos和c-jun蛋白表达水平，而且此作用在10^-9～10^-7 mol/L浓度范围内呈剂量依赖性，提示雌激素可能通过影响软骨细胞c-fos和c-jun表达而影响了软骨内成骨过程。

参考文献

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2，McCabe LR, Banerjee C, Harrospm RJ, et al. Developmental expression and activities of specific Fos and Jun proteins are functionally related to osteoblast maturation: role of Fra-2 and Jun D during differentiation. Endocrinology, 1996,137:4398-4408.

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7，Dony C, Gruss P. Proto-oncogene c-fos expression in growth regions of fetal bone and mesodermal web tissue. Nature, 1987,328:711-714.

8，Wang ZQ, Qvitt C, Grigoriadis AE, et al. Bone and haematopoietic defects in mice lacking c-fos. Nature, 1992,360:741-745.

9，Peach K, Webb P, Kuiper GGJM, et al. Differential ligand activation of estrogen receptors (ER) α and ERβ at AP-1 sites. Sciences, 1997,277:1508-1510.

(收稿日期：1999-05-07)