关键词： 受体，促甲状腺激素；自主性功能性甲状腺腺瘤；基因突变

【摘要】目的研究TSH受体(TSHR)基因突变在自主性功能性甲状腺腺瘤(AFTA)发病中的作用。方法以14例AFTA作为研究对象，另4例为毒性多结节性甲状腺肿、7例扫描呈“冷结节”的甲状腺腺瘤及AFTA周围正常甲状腺组织作为对照，酚-氯仿-异戊醇法提取基因组DNA，对目的基因片段进行聚合酶链反应—单链构象多态性(PCR-SSCP)分析及DNA序列分析。结果在14例自主性功能性甲状腺瘤标本中，SSCP检测出6例条带变异的个体(43%)，对其中3例进行DNA序列测定，发现1例为620位密码子的点突变，苏氨酸被脯氨酸置换(T620P，ACC→CCC)。2例为单碱基插入突变，在1972与1973位核苷酸之间插入了一个腺嘌呤核苷酸(A)，使得密码子624位以后的氨基酸发生了移码突变。在对照组未发现TSHR基因突变。结论TSHR基因突变可能在自主性功能性甲状腺腺瘤的发病中起重要作用。

Study on the TSH receptor gene mutations of autonomously functioning thyroid adenoma

LI Xueping,SHI Bingyin,XUE Mingzhan

（Department of Endocrinology,First Affiliated Hospital,Xi'an Medical University,Xi'an 710061）

【Abstract】ObjectiveTo obtain more information concerning the thyrotropin receptor (TSHR) gene mutations in the pathogenesis of autonomously functioning thyroid adenomas (AFTAs). Methods14 diagnosed AFTAs were analyzed, with 4 toxic multinodular goiters, 7 thyroid adenomas (cold nodule on scintiscan) and normal thyroid specimens adjacent to the tumours as controls. The genomic DNA was extracted with phenol-chlormethyl-isoamyl alcohol extraction and ethanol precipitation. The 155 base pairs DNA fragments which encompasses the third cytoplasmic loop and the sixth transmembrane segments in the TSHR exon 10 were amplified by PCR and analyzed by the single-strand conformation polymorphism (SSCP). Direct sequencing of the PCR products was performed with ABI Prism Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit. ResultsIn SSCP analysis, 6 autonomously functioning adenomas of 14 patients displayed migration abnormally (43%). In sequence analysis of 3 abnormal migrated samples, one substitution at nucleotide 1957 (A to C), and two same insertion mutations of one adenosine nucleotide (A) insertion between nucleotide 1972 and 1973 were identified. No mutations were found in controls. ConclusionBoth one-point substitution mutation and one-base insertion mutation of the TSHR gene may be responsible for the pathogenesis of the autonomously functioning thyroid adenomas.

【Key words】Receptor, thyrotropin; Autonomously functioning thyroid adenoma; Gene mutation

自主性功能性甲状腺腺瘤(AFTA)是甲状腺良性腺瘤的一种，多见于中老年人群，以同位素甲状腺扫描呈“热结节”、伴有或不伴有甲状腺激素增高及临床甲亢症状为其特征。本病病因尚不清楚。促甲状腺激素受体(TSHR)—腺苷酸环化酶—cAMP系统对甲状腺细胞的增殖分化、激素合成起重要作用，AFTA的瘤组织该系统活性很高，且对TSH的刺激无反应。近年来国外报道TSHR基因突变后使该受体-cAMP第二信使系统处于持续激活状态，可能是AFTA发病的原因^〔1-9〕。本研究对中国人AFTA患者的TSHR基因片段进行了分析，以探讨TSHR基因突变在我国AFTA发病中的作用。

对象和方法

一、对象

选择AFTA患者14例的腺瘤组织及AFTA的周围正常甲状腺组织，另4例为毒性多结节性甲状腺肿(TMG)、7例扫描呈“冷结节”的甲状腺腺瘤作为对照。AFTA病例选择标准：(1)有心动过速，消瘦，乏力和腹泻等甲亢症状；(2)放射性碘吸收率正常或稍高，T₃抑制试验示¹³¹I摄取率不受外源性T₃抑制，TRH刺激试验不能被兴奋；(3)T₃升高，或T₃、T₄同时升高；(4)¹³¹I或^99mTc同位素扫描有特征性改变：腺瘤部位呈“热结节”，周围甲状腺组织和健侧甲状腺腺叶显示很淡或不显示；(5)术后病理证实为甲状腺腺瘤。

二、标本采集

1.石蜡包埋组织标本：取自1992～1998年本院病理科石蜡包埋组织，包括11例AFTA及3例TMG，7例呈“冷结节”的甲状腺腺瘤。切片后经HE染色，在光学显微镜下区分甲状腺腺瘤和正常甲状腺组织，再分别切片备用。

2.外科手术标本：取自1997～1998年本院外科手术，3例AFTA，1例TMG。分别在手术过程中切取肿瘤组织及正常甲状腺组织，漂净血液，消毒滤纸吸干，液氮中冻存备用。

三、方法

1.石蜡包埋组织DNA的提取：标本加入STE液，加热至80℃脱蜡，500 μg/ml蛋白酶K消化过夜，采用常规酚-氯仿-异戊醇提取基因组DNA。

2.新鲜组织DNA的提取：400 μg/ml蛋白酶K消化3～6小时后，采用常规酚-氯仿-异戊醇提取基因组DNA。

3.引物选择：设计外引物S和内引物P，进行巢式PCR，扩增片段包括第6穿膜片段第3胞内袢。引物S序列来自文献，引物P为自行设计，其序列分别如下：外显子10，扩增片段长为535bp：S1 5'-TATTGTTTTTGTTCTGACGCT-3',S2 5'-TACT-CTTCTGAGATTTGGCC-3'；外显子10，扩增片段长度为155bp：P1 5'-TGAAGATCTACATCACAG-TCCGAA-3',P2 5'-GAGAGGCTTGTTCAGAAT-TGCTG-3'。

4.PCR反应：首先用S引物进行扩增，将相应反应成分混合后，94℃预变性5 min，94℃ 50s，52℃ 50s，72℃ 50s，共循环38次，循环完成后72℃延伸7 min，然后取0.5～1.0 μl上述S引物扩增产物作为模板，用P引物扩增，94℃预变性5 min，94℃ 50s，62℃ 50s，72℃ 50s，共循环35次，循环完成后72℃延伸7 min，用2%琼脂糖电泳观察PCR产物扩增情况，如在相应位置有清晰扩增带，则可进行下一步的单链构象多态性(SSCP)电泳分析。

5.SSCP分析：采用10%的甘油聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压200V，恒温8℃，电泳4～6小时。

SSCP结果判断：每次电泳都以正常甲状腺组织扩增产物作为对照，若同时电泳的肿瘤标本与正常相比，出现条带增多、减少或位置变动即说明存在变异。每份标本均保证至少2次以上的PCR扩增和SSCP分析。

6.DNA测序：扩增产物用DNA纯化试剂盒纯化回收。采用ABI 377型PCR自动测序仪测序，计算机判读碱基序列。

结果

一、PCR-SSCP筛查的TSHR基因变异

在14例AFTA的石蜡包埋组织中检出了3例具有相同SSCP电泳条带变异的标本，表现为电泳条带增多，即正常为4条带，变异者为5条带(图1)。而4例新鲜外科手术标本中发现了两种不同的SSCP电泳条带改变，正常为4条带，一种变异为2条带，另一种变异为3条带(图2)。共计发现6例带型有变异的个体，均为自主性功能性甲状腺腺瘤，占43%(6/14)，腺瘤周围正常甲状腺组织及其余对照均未发现变异。

二、突变的位置和性质

对新鲜手术标本中PCR-SSCP检测有变异的3例、未发现变异的1例TMG和1例肿瘤周围正常甲状腺组织，共计5例标本测序，结果发现3例变异标本中1例为点突变，第620位密码子的第一碱基，即第1957位核苷酸发生A→C转换，使该密码子由

DS：双链DNA Double-strand DNA; M：pGEN-7Zf(+)/HaeⅢ Marker; n:正常带型 Normal individual; W:异常带型 Abnormal individual

图1石蜡包埋标本PCR-SSCP分析结果(银染法)

Fig 1PCR-SSCP profiles of specimens from paraffin-embeded tissue (silver staining)

n:正常带型 Normal individual; WW'：异常带型 Abnormal individual; DS：双链DNA Double-strand DNA; M：pGEN-7Zf(+)/HaeⅢ Marker； 其中W为测序确认有插入突变个体，W'为点突变个体标本1，2，3，4和5 PCR后测序。标本3在核苷第1957位确定有点突变(A→C)，标本2，3在核苷酸第1972与1973位之间有插入突变 Sample 1、2、3、4 and 5 were sequenced after PCR. Among them Sample 3 was identified as point mutation at nucleotide 1957 (A to C), Sample 2 and 5 were identified as insertion mutation between nucleotide 1972 and 1973

图2新鲜组织SSCP分析结果

Fig 2PCR-SSCP prafiles of fresh surgical tissue specimens (silver staining)

ACC突变为CCC，苏氨酸被脯氨酸置换(T620P)。2例突变性质相同，在1972与1973位核苷酸之间插入了一个腺嘌呤核苷酸(A)，使得密码子624位以后的氨基酸发生了移码突变。另外2例在SSCP分析中带型无变异的标本，测序序列正常。

讨论

本研