甲状腺激素(TH)可直接或间接调控多种脑结构基因的表达^〔1〕，但TH和脑功能相关基因，尤其信号蛋白编码基因的调节关系，至今仍研究较少。近来，我们的系列研究发现围生期甲减大鼠对下丘脑某些核团Go蛋白α亚基(Goα)基因的表达具有显著的上调作用^〔2〕。考虑到海马结构是参与学习、记忆等认知活动的重要中枢部位，而也是广泛表达Goα的脑区之一^〔3〕，本研究进一步观察TH对发育期大鼠海马及齿状回Goα基因表达的调节作用，并对照研究TH对该脑区Gs蛋白α亚基(Gsα)基因表达的影响。

一、材料与方法

1.材料：孕Wistar大鼠，FT₃、FT₄测定试剂盒，Goα及Gsα寡核苷酸，地高辛标记及检测试剂盒，丙基硫氧嘧啶(PTU)等材料来源同前^〔2〕。

2.方法：(1)动物模型的建立及FT₃、FT₄测定：孕15日Wistar雌性大鼠，分组，甲减模型的制备方法同前^〔2〕，至仔鼠出生21日为止。FT₃及FT₄的测定方法同前^〔2〕。21日龄甲减幼鼠的体重、FT₃、FT₄均显著低于正常对照组^〔2〕。(2)脑切片制作：21日龄甲减和正常幼鼠，先后以30 ml生理盐水、30 ml 4%多聚甲醛通过心脏灌注后剥离全脑，再4%多聚甲醛固定后，进行脑冠状位冰冻切片，片厚25 μm，置蔗糖保护液中，-20℃保存。(3)探针制备，原位杂交试验及图象分析：取100 pmol Goα及Gsα寡聚核苷酸片段，地高辛标记方法同前^〔2〕。挑取含海马部位的切片，漂洗、固定后，蛋白酶K消化20 min，分别与Goα、Gsα探针及无关探针进行杂交。再与抗DIG抗体Fab段反应，最后以5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)和氮蓝四唑(NBT)显色。原位杂交结果的灰度扫描及统计学分析同前^〔2〕，mRNA强度以阳性显色面积百分比/细胞面积表示。

二、结果

1.甲减对21日龄Wistar大鼠海马各区及齿状回Goα mRNA的影响：原位杂交结果显示，Goα mRNA分布于21日龄大鼠海马CA1、CA2、CA3、CA4区及齿状回部位。21日龄甲减鼠海马CA1～4及齿状回Goα mRNA表达水平显著高于正常对照组。原位杂交结果经扫描分析表明，CA1～4及齿状回细胞平均Goα mRNA阳性面积密度均高于正常对照组。

2.甲减对21日龄Wistar大鼠海马各区及齿状回Gsα mRNA的影响：Gsα mRNA分布于21日龄大鼠海马CA1、CA2、CA3、CA4各区及齿状回部位。21日龄甲减大鼠海马各区及齿状回Gsα mRNA的阳性显色与正常对照组相似。原位杂交图像经灰度扫描表明，该区域细胞平均Gsα mRNA阳性面积密度与正常对照组差异无显著性。

三、讨论

G蛋白介导的信号传导过程在神经细胞的生长、分化、代谢及功能活动中发挥着十分广泛而又基础的作用。由于Go蛋白是神经组织中含量最多的一种G蛋白亚型，而α亚基又是G蛋白的功能及特异性的决定成分，因此研究不同脑区Goα基因的表达与TH的调节关系，将有助于我们对脑发育的生理机制及甲减性脑损伤的病理机制的了解。

海马CA1～4区、齿状回及下托组成大鼠的海马结构，它是调节多种认知活动及情绪反应的大脑中枢部位。Chang等应用免疫组化方法研究发育期鼠脑Goα的分布，发现海马CA1，CA3区锥体细胞及齿状回的颗粒细胞具有Goα的强阳性显色^〔4〕，但目前仍缺少关于发育期鼠脑海马结构Goα mRNA分布特征的研究。我们通过原位杂交试验，观察到Goα mRNA表达于21日龄大鼠脑海马CA1～4区及齿状回，结果显示发育期大鼠海马结构Goα的分布及表达在mRNA水平上较在蛋白水平更为显著。

尽管有少量的研究显示甲减可引起发育期大鼠皮层Goα蛋白水平的升高^〔5〕，但关于TH与鼠脑海马结构Goα基因表达的调节关系，目前尚无报道。我们曾研究发现，TH对发育期大鼠下丘脑弓状核及腹内侧核Goα mRNA的表达具有负调作用。基于该研究结果，本研究应用原位杂交技术，进一步观察TH对新生期鼠脑海马结构Goα mRNA的影响。研究发现21日龄甲减大鼠脑海马CA1～4、齿状回Goα mRNA的水平显著高于正常对照组，表明TH对发育期鼠脑海马结构Goα基因的表达具有负调作用。研究结果提示，TH可通过对Goα信号传导系统的负调作用参与海马结构的发育及功能活动。

Gsα是一类和Goα功能相反的刺激型G蛋白α亚基，我们观察到Gsα mRNA可分布于21日龄鼠脑海马结构各区域。关于TH和发育期鼠脑Gsα基因表达的调节关系目前尚未见报道。本研究观察了TH与新生期大鼠海马结构Gsα基因表达的影响，发现甲减21日龄鼠脑海马CA1～4区及齿状回Gsα mRNA水平与正常对照组差异无显著性，表明发育期鼠脑海马结构Gsα信号系统和TH无显著调节关系。

综上研究可知，在大鼠脑海马的发育过程中，TH对抑制性Goα信号系统和刺激性Gsα信号系统具有不同的调节作用。我们知道，海马CA1～4区及齿状回与学习和记忆行为有密切关系，当两侧海马受到损伤时，可引起近期记忆的高度丧失及轻微的行为改变，并失去学习新事物及新技巧的能力。现在还认为，海马结构尚参与情绪反应，内脏活动，并对脑干网状结构的上行激动系统有影响。本研究表明，甲状腺激素对Goα信号系统的负调作用是维持海马正常发育及上述诸功能活动的重要生理基础。根据临床观察或动物试验，甲状腺功能低下可引起认知障碍，情绪低落，表情淡漠，以及心率减慢、血压降低、胃肠蠕动减缓等表征，这些改变可能与大脑海马结构的发育或功能改变有关。本研究发现，甲减可引起海马结构抑制性Goα基因表达的普遍上调，这可能是导致上述甲减性神经、精神症状的一个重要环节，因此本文结果也为揭示甲减性脑损伤的分子机制提供了重要的依据。

参考文献

1，Oppenheimer JH, Schwartz HD. Molecular basis of thyroid hormone-dependent brain development. Endocr Rev, 1997,18:462-475.

2，蔡东升， 罗敏， 陈源， 等. 甲状腺激素对新生鼠下丘脑Go蛋白亚单位的影响. 中华内分泌代谢杂志， 1999，15：286-290.

3，Parolaro D, Rubino T, Gori E, et al. In situ hybridization reveals specific increases in Gαs and Gαo mRNA in discrete brain regions of morphine-tolerant rats. Eur J Pharmacol, 1993,244:211-222.

4，Chang KJ, Pugh W, Blanchard SG, et al. Antibody specific to the α subunit of the guanine nucleotide-binding regulatory protein Go: developmental appearance and immunocytochemical localization in brain. Proc Natl Acad USA, 1988,85:4929-4933.

5，Leung FL, Saggerson ED, Clark JB. Signal transduction processes in the developing brain: pertubations of G protein alpha-subunit abundances by perinatal hypothyroidism. Dev Neurosci, 1996,18:153-161.

(收稿：1999-02-10)