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Effects of high concentrations of insulin and glucose on the protein kinase C activities of HepG2 cells
YE Juan,LI Guo,CHEN Jialun
Shanghai Institute of Endocrinology,Shanghai,200025
【Abstract】ObjectiveTo study the effec?s of high concentrations of insulin and glucose on the prot?in kinase C (PKC) activities of HepG2 cells.MethodsA model of receptor down-regulated HepG2 (DR-HepG2) cells with characteristics of insulin resistance was developed. The membrane and cytosolic PKC activities of NDR-HepG2 cells and DR-HepG2 cells stimulated by 10-7mol/L insulin and 25mmol/L glucose were measured.Results Without stimulation by 10-7mol/L insulin or 25mmol/L glucose, the PKC activities of membrane and cytosol of the DR-HepG2 cells were higher than those observed in NDR-HepG2 cells (P＜0.05). 10-7mol/L insulin induced biphasic increases of membrane PKC activities by NDR-HepG2 cells and DR-HepG2 cells (P＜0.01), the initial increase being at 30 sec and the secondary at 5～10min. Meanwhile, the activities of cytosolic PKC reduced markedly. 25mmol/L glucose induced biphasic increases of the membrane PKC activities by NDR-HepG2 cells and DR-HepG2 cells (P＜0.01). At the same time the activities of cytosolic PKC increased slightly by NDR-HepG2 cells or decreased by DR-HepG2 cells. The effects of 25mmol/L glucose were parallel to those when 10-7mol/L insulin and 25mmol/L glucose were treated simultaneously.ConclusionThe up-regulation of PKC may be related to the insulin resistance of DR-HepG2 cells. 10-7mol/L insulin or 25mmol/L glucose induced biphasic increases of membrane PKC activities of NDR-HepG2 cells and DR-HepG2 cells. But the effects on cytosolic PKC were different. PKC may be activated through the glucose-induced mechanisms mainly when insulin and glucose were treated s multaneously.
【Key words】Protein kinase CInsulinGlucoseHepG2 cells
(Chin J Endocrinol Metab, 1999,15:294-297)
蛋白激酶C(PKC)是一族普遍存在于细胞内的专一性蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸化激酶，广泛参与细胞生长分化、基因表达调控、激素和神经递质的分泌、跨膜信号传递、受体失敏和介导免疫反应等〔1〕。胰岛素、葡萄糖或其它激动剂通过二酰甘油(diacylglycerol, DG)途径激活PKC，后者通过其蛋白质磷酸化作用产生一系列生物效应。但是，一种或多种PKC亚型的过度激活可导致胰岛素受体信号传递的减弱，如磷酸化胰岛素受体β亚单位丝氨酸/苏氨酸残基使其酪氨酸激酶活性降低、抑制糖原合成酶活性等，与胰岛素抵抗密切相关〔2，3〕；过度激活的PKC还可能通过增加肾小球内皮细胞通透性、刺激肾系膜细胞合成基质蛋白等机制参与糖尿病肾病的病理改变〔4〕；高糖介导的PKC激活可改变一些与血管功能有关的酶或蛋白质的活性和基因表达，导致大小血管功能紊乱，是糖尿病慢性并发症的发病因素之一〔5，6〕。
受体下调HepG2(DR-HepG2)细胞既具有肝细胞的代谢特点，又有胰岛素受体和受体后功能缺陷〔7，8〕，是研究糖尿病及胰岛素抵抗的理想细胞模型。本研究以未处理HepG2(ND-HepG2)细胞和(DR-HepG2)细胞为研究对象，观察10-7mol/L胰岛素或25mmol/L葡萄糖及二者同时刺激对二种不同状态下HepG2细胞膜和胞浆PKC活性的影响，探讨PKC在糖尿病和胰岛素抵抗中的潜用。
材料和方法
一、材料
HepG2细胞株购于日本筑波细胞库。Ac-MBP(4-14)、PKC(19-36)、PMA、磷酸纤维素薄膜等购于Gibco公司。32P-ATP、14C-葡萄糖购于Dupont公司。125I-胰岛素购于Amersham公司。其余试剂购于Sigma公司。
主要仪器：超净工作台(苏州净化设备厂)；CO2温箱(Napco,5410型)；超速离心机(Beckman,Optima)等。
二、方法
1.细胞培养：HepG2细胞培养于细胞培养板，10%小牛血清的DMEM培养液、37℃、5%CO2温箱中孵育。(DR-HepG2)细胞模型的建立：单层贴壁HepG2细胞置于含10-7mol/L胰岛素的DMEM培养液中孵育24小时。弃培养液，于4℃条件下用预冷的pH 4.0的DMEM培养液和0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)分别洗涤细胞5次，即成为DR-HepG2细胞。
2.残余125I-胰岛素结合率测定：NDR-HepG2细胞或DR-HepG2细胞置于含10-9mol/L或10-7mol/L胰岛素的DMEM培养液中孵育24小时。弃培养液，于4℃条件下，用预冷的p4.0的DMEM培养液及0.01mol/L PBS分别冲洗5次。每孔中加2ml含3μCi125I-胰岛素的DMEM培养液，4℃孵育3小时。弃培养液用0.01mol/L PBS 冲洗5次，每孔中加入0.25%胰酶1ml，室温消化25分钟，用含15%小牛清的DMEM培养液终止反应。吹打细胞并移入测试管中，用1ml PBS洗5次，洗液一并加入测试管中，2000rpm离心10分钟。弃上清，测沉淀物放射计数。用10-7mol/L胰岛素与125I-胰岛素竞争结合后的残余125I-胰岛素结合量作为非特异性结合。未用胰岛素刺激的HepG2细胞残余125I-胰岛素结合作为对照。
3.14C-葡萄糖掺入试验：NDR-HepG2细胞或DR-HepG2细胞置于含3%小牛血清的DMEM培养液中孵育24小时或48小时。弃培养液后每孔中加入3μCi14C-葡萄糖及2ml含10-9mol/L或10-7mol/L胰岛素的DMEM培养液，孵育24小时后弃培养液，用0.01mol/L PBS洗5次。每孔中加入1ml NaOH，37℃裂解细胞2小时。取裂解液200μl加入10ml闪烁液中，混匀过夜，测放射性计数。
4.PKC活性测定：按照Gibco公司的PKC测试系统及Yasuda等〔9〕报道的PKC活性测定原理与方法。含10-7mol/L胰岛素或25mmol/L葡萄糖或10-7mol/L胰岛素+25mmol/L葡萄糖的DMEM培养液刺激NDR-HepG2细胞或DR-HepG2细胞，时间分别为0，30秒，1分，3分，5分，10分，15分。(1)超速离心法分离胞浆及膜部分PKC粗提物。(2)PKC活性测定：Ac-MBP(4-14)是髓鞘磷脂基质蛋白的一个合成片段，其中8号氨基酸为丝氨酸残基，是PKC的特异性磷酸化底物。测定反应产物的32P掺入量来反映PKC活性。PKC(19-36)是PKC磷酸化反应的特异性抑制剂，其存在时测得的结果作为非特异性反应。(3)计算结果并以粗提物的A280值校正。
5.统计学方法：数据以x±s表示；两两比较用t检验。
结果
一、残余125I-胰岛素结合率
超生理浓度(10-7mol/L)和生理浓度(10-9mol/L)胰岛素刺激24小时后，DR-HepG2细胞残余125I-胰岛素结合率明显低于NDR-HepG2细胞，前者为(434±233)cpm，(835±230)cpm，后者为(818±153)cpm,(1018±201)cpm(P＜0.01)。随着胰岛素浓度的增高，NDR-HepG2细胞和DR-HepG2细胞残余125I-胰岛素结合率降低。
二、14C-葡萄糖掺入试验
10-9mol/L和10-7mol/L胰岛素刺激24小时后，DR-HepG2细胞14C-葡萄糖掺入量明显低于NDR-HepG2细胞。前者为(1477±360)cpm，(700±314)cpm，后者为(3128±233)cpm，(1396±201)cpm(P＜0.01)。48小时后的DR-HepG2细胞14C-葡萄糖掺入量轻度增加，仍明显低于NDR-HepG2细胞，前者为(1610±187)cpm，(891±154)cpm，后者为(3128±233)cpm，(1396±201)cpm(P＜0.01)。
