关键词： 细胞间粘附分子-1；整合素；糖尿病大鼠；糖尿病视网膜病变

【摘要】目的探讨粘附分子在糖尿病视网膜病变(DR)发病中的作用。方法应用链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型，分别于成模后3个月和6个月时经光镜和透射电镜观察视网膜的形态学改变。应用免疫组化方法及微机图像处理系统，对视网膜组织细胞间粘附分子-1(ICAM-1)及整合素族CD61的分布与含量进行动态观察与分析；应用流式细胞术测定循环血中粒细胞表面β₂整合素族CD11a、CD11b的表达。结果病变3月组已有ICAM-1及CD61的表达明显增加，并随病程延长表达进一步增多，而在正常对照组未见明显表达(P＜0.01)。糖尿病大鼠粒细胞表面抗原CD11a、CD11b阳性细胞群体所占的比例较对照组显著升高(P＜0.001)。视网膜毛细血管基底膜厚度与ICAM-1、CD61表达灰度值呈显著正相关(r=0.772,0.694,P＜0.05)。结论粘附分子与其配基过度表达，加重内皮细胞损伤及微血管栓塞，很可能是导致DR发生中进展性微血管病变的重要因素之一。

A preliminary study on the relationship between adhesion molecules and diabetic retinopathy in diabetic rats

YUAN Mingxia,YUAN Shenyuan,LIU Yuantao,et al.

Department of Diabetes and Microcirculation,Tong Ren Hospital,Beijing,100730

【Abstract】ObjectiveTo explore the role of adhesion molecules in the development of diabetic retinopathy (DR) in diabetic rats.MethodsDiabetes model was established in Wistar rats by induction with streptozotocin (STZ). The early changes of retinae were examined using light microscope and transmission electron microscope. Immunohistochemistry was employed to analyse the expression of ICAM-1 and CD61 (integrin β₃ chain) in diabetic retinae. Flow cytometric analysis was applied to detect the expression of CD11a (LFA-1 α chain) and CD11b (MAC-1 α chain) on the surface of neutrophils isolated from the systemic circulation.ResultsThe early stages of ocular lesions occured in the retinae of diabetic rats at 3 months. The nondiabetic retinae demonstrated relatively little ICAM-1 immunoreactivity and CD61 immunoreactivity was rarely observed. While ICAM-1 and CD61 immunoreactivity was consistently greater than that observed in normal retinae (P＜0.01). The increased expression occurred before visible retinal pathological changes. A significant increase in number of neutrophils isolated from systemic circulation, which expressed CD11a/CD11b was found in the pathologic group as compared with the control group (P＜0.001). The thickness of capillary basement membrane was correlated positively with the immunoreactivities of ICAM-1 and CD61 in the retinae.ConclusionThe results indicate that increased intercellular adhesion molecules may be the main inductive mediator and play an important role in the progression of diabetic retinal microangiopathy.

【Key words】Intercellular adhesion molecule-1IntegrinDiabetic ratDiabetic Retinopathy

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最为常见和严重的微血管并发症之一，并已成为四大主要致盲疾病之一。关于DR的发病机制，近十年已在分子水平的研究中取得较大进展^〔1〕，认为DR的发生与多种因素的协同作用有关。近年来，基于对粘附分子结构和功能不断深入的了解，粘附分子在DR发生中的作用已日益引起国内外学者的关注。但国内尚未见有关文献报道。本实验旨在了解粘附分子在DR中的含量及分布，探讨粘附分子在DR发生中的作用。

材料和方法

一、糖尿病大鼠模型的建立

选用成年雄性纯系Wistar大鼠(北京医科大学实验动物科学部)45只，体重200～250克，单只代谢笼分笼饲养。制模前对大鼠进行全身及眼部检查以除外原发性疾患。动物禁食10小时后，将链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)溶液以60mg/kg剂量一次性腹腔注射。用药2周后将空腹血糖大于16.6 mmol/L、尿糖持续阳性者选定为糖尿病模型动物。实验大鼠分为三组：制模前随机选择10只健康动物为正常对照组；成模动物随机分为病变3月组和病变6月组。用One Touch Ⅱ型血糖仪(美国Lifescan公司)尾静脉取血测定血糖。采用德国Bayer公司DCA2000仪器及试剂盒于杀检时下腔静脉取血测定糖基化血红蛋白(HbA₁c)。

二、视网膜组织的形态学观察

以2%戊巴比妥钠按45mg/kg剂量腹腔注射麻醉，迅速开腹，下腔静脉取血待用。迅速摘除眼球。

1.光镜观察：取一只眼球置入10%中性福尔马林固定，常规梯度酒精脱水，石蜡包埋，制成4μm石蜡切片，苏木素-伊红(HE)染色。

2.透射电镜观察：取另一只眼球立即置于预冷的3%戊二醛中，于4℃冰箱中固定1小时，沿角膜缘剪开眼球，去除眼前节及玻璃体，用锋利刀片取眼球后壁组织(周边部)数块，约1mm×3mm大小，1%锇酸后固定，EPON812包埋，半薄定位，超薄切片，铅铀染色，透射电镜(JEM-2000EX,Japan)下观察。同时对视网膜毛细血管基底膜摄影(×12K)，每例标本随机取至少5张不同部位的照片，用图像分析仪(MPV-TASPLUS，德国Leitz公司，中国科学院生物物理所计算机图像分析室)对基底膜厚度进行定量测量，取其平均值作为每一例标本的基底膜厚度。

三、视网膜组织ICAM-1及CD61(Integrin β₃ chain)的免疫组织化学分析

1.试剂：生物素-链霉亲和素标记蛋白显色试剂盒(S-P Kit，美国ZYMED公司)，小鼠抗大鼠ICAM-1单抗(Seikagaku Corporation, Japan)，小鼠抗大鼠CD61(Integrin β₃ chain)单抗(美国Pharmingen公司)。

2.方法：摘除后的眼球制成4μm石蜡切片，按照常规免疫组织化学程序进行。

3.视网膜组织毛细血管内皮细胞ICAM-1及CD61表达半定量测定：仪器：微机控制的荧光显微电视图像自动测量系统(中国医学科学院基础医学研究所病理生理研究室与清华大学电机系联合研制)；方法：将免疫组化照片负片通过摄像系统输入图像处理系统，图像显示于终端屏幕。设定域值TH=165，窗口面积40×40(像束)，测定图像中血管内皮细胞区域的面积灰度，每张片测定5个点，取其均值作为每一例的平均灰度。平均灰度值越高，说明免疫组化信号越强。

四、糖尿病大鼠血中粒细胞表面抗原CD11a、CD11b流式细胞测定

1.抗体：小鼠抗大鼠LFA-1 α chain (CD11a)抗体，小鼠抗大鼠MAC-1 α chain(CD11b)抗体(Seikagaku corporation, Japan)，荧光标记Ⅱ抗(FITC标记羊抗小鼠IgG，Sigma公司)。

2.方法：取5ml肝素抗凝血，分离粒细胞。计数(涂片鉴定)后，取10⁶细胞/管，每例标本分为标记管与对照管两管，70%乙醇固定，置4℃保存，待测。取待测管离心(1200rpm×5min)→吸上清，保留管底细胞→于标记管中加入CD11a(CD11b)抗体(即I抗，1:50)20μl，对照管加等量PBS，置4℃，30min→PBS液1ml洗(1200rpm×5min)2次→弃上清，加荧光标记Ⅱ抗(FITC标，1:50，20μl)，置4℃，30sec→取出后PBS洗2次(同上)→弃上清后加固定液1ml，将细胞混匀，封口，置4℃待测。应用Becton-dickinson FACS 420型流式细胞仪(中医研究院仪器测试中心)测定待测管中粒细胞表面CD11a、CD11b的荧光强度。

五、统计学处理

所有数据用spss for windows 6.0处理，结果以±s表示，组间比较用方差分析，若有显著性差异，两组间比较用Student-Newman-Keuls检验，两变量间的线性关系用相关分析。

结果

一、各病变组血糖与糖化血红蛋白

病变3月组、病变6月组血糖分别为(20.26±1.94)、(21.92±1.27)mmol/L，HbA₁c分别为(9.23±0.62)%、(9.04±0.64)%，二者均显著高于对照组〔(4.43±0.81)mmol/L,(3.25±0.18)%,P＜0.01〕。病变3月组与6月组之间血糖及HbA₁c均无明显差异(P＞0.05)。

二、视网膜组织的形态学观察结果

光镜下对照组大鼠视网膜组织的基本结构共分为10层，各层次分明，排列有序。病变6月组视网膜组织各层次结构明显疏松、细胞排列松散、不规则，组织明显水肿，内外核层分离。病变3月组变化不明显。

视网膜组织透射电镜观察(图1～3)：同对照组相比，病变6月组出现以下改变：(1)内外核层部分核染色质浓缩，分布不均匀。(2)核膜结构不完整，核间隙增宽。(3)周细胞内少数线粒体肿胀、核变性。(4)内皮细胞以核为中心胞体向管腔内突