关键词： 解偶联蛋白2；胰岛素分泌；基因变异；2型糖尿病

【摘要】目的解偶联蛋白2(UCP2)基因定位于人类11q染色体区，该区域与高胰岛素血症及肥胖相关连。本研究拟探讨UCP2基因Ala55Val(A/V55)变异与中国人2型糖尿病患者胰岛素分泌/敏感性的关系。方法359例无亲缘关系的中国人(据97年ADA标准分为：糖耐量正常者193例，2型糖尿病166例)及66例白种人用PCR-RFLP检测UCP2基因A/V55变异。结果中国人(AA 0.31，AV 0.51及VV 0.18)与白种人(AA 0.32，AV 0.56及VV 0.12)UCP2基因A/V55变异的基因型频率分布无显著差异(P=0.615)，且该基因变异与中国人2型糖尿病发病无相关性(P=0.558)。在166例2型糖尿病患者中，UCP2基因A/V55变异与糖负荷3小时胰岛素总值(SUM)(P=0.0108)，胰岛素曲线下面积(AUC)(P=0.0149)以及HOMAβ细胞功能(P=0.0174)相关。且糖负荷3小时C肽总值及C肽曲线下面积变化亦与胰岛素有相同趋势。结论UCP2基因A/V55变异与中国人2型糖尿病患者葡萄糖兴奋后胰岛素分泌(GSIS)功能相关，提示该变异可能参与了中国人2型糖尿病胰岛素分泌不足的病理生理过程。

Association between Ala55Val variant in the uncoupling protein 2 gene and glucose stimulated insulin secretion in type 2 diabetic Chinese

ZHENG Yiman,XIANG Kunsan,ZHANG Rong,et al.

Department of Endocrinology and Metabolism,Shanghai Sixth People's Hospital,200233

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between Ala55Val (A/V55) variant in the uncoupling protein 2 (UCP2) gene and insulin secretion/sensitivity in type 2 diabetic Chinese.MethodsBy means of PCR-RFLP assay, the genotypes of A/V55 variant in the UCP2 gene were determined in 359 unrelated Chinese 〔including 193 with normal glucose tolerance (NGT) and 166 type 2 diabetics (DM) according to ADA 1997 criteria〕 and 66 normal Caucasian subjects.Results No significant difference (P=0.615) of genotype frequencies of the A/V55 variant in the UCP2 gene was observed between Chinese (AA 0.31, AV 0.51 and VV 0.18) and Caucasians (AA 0.32, AV 0.56 and VV 0.12). There was also no difference in genotype frequencies between type 2 diabetics and NGT group (P=0.558). All the observed genotype frequencies were in Hardy-Weinberg equilibrium. Among the 166 type 2 diabetic Chinese, A/V55 variant in the UCP2 gene was correlated with the area under curve (AUC) of the insulin (P=0.0149) and the sum of the insulin values (P=0.0108) during oral glucose tolerance test (OGTT), as well as with HOMA β cell function (P=0.0174). The changes of the AUC and the sum of C-peptide levels after 75g glucose challenge showed the same tendency.Conclusion A/V55 variant in the UCP2 gene is correlated with the glucose stimulated insulin secretion from islet β cell in type 2 diabetic Chinese. It is suggested that A/V55 variant in the UCP2 gene may contribute to the dysfunction of insulin secretion in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus in Chinese.

【Key words】Uncoupling protein 2 geneInsulin secretionGene variantType 2 diabetes mellitus

2型糖尿病是一种由遗传及环境因素共同作用引起的复杂病(complex disease)，其病理生理过程包括胰岛素分泌不足和(或)作用不足。研究表明体脂含量过多及分布异常与2型糖尿病的发生密切相关。作为质子运载体的解偶联蛋白(uncoupling proteins, UCPs)参与了机体能量平衡的调节过程，从而影响机体的体脂含量及分布^〔1〕。

1997年UCP2基因首次被定位克隆于人类染色体11q13，该区域与高胰岛素血症及肥胖相连锁。与UCP1基因(染色体4q31)不同的是UCP2基因在人类的许多组织及器官中广泛表达，包括：骨胳肌、脂肪、肺、心、肾、胎盘、胃及胰腺^〔2〕。Bouchard等对Quebec家系的研究认为UCP2基因区与机体静息代谢率，体重指数(body mass index, BMI)及体脂百分含量间存在连锁关系^〔3〕。本文以UCP2基因Ala55Val(A/V55)变异作为标记，研究其与中国人2型糖尿病及其病理生理过程—胰岛素分泌与胰岛素作用的关系。

对象和方法

一、对象

1.选取无亲缘关系的上海地区中国人(汉族)359例，按美国糖尿病学会(ADA)1997年糖尿病诊断标准^〔4〕分为糖耐量正常组(NGT)：其空腹血浆糖≤6.1mmol/L且口服75g葡萄糖后2小时血浆糖≤7.8mmol/L，共193例(男/女为84/109)，年龄(53±12)岁，BMI(25.61±4.33)kg/m²；2型糖尿病组(2型DM)：有“三多一少”症状，且空腹血浆糖≥7.0mmol/L或口服75g葡萄糖后2小时血浆糖≥11.1mmol/L，无“三多一少”症状，空腹血浆糖≥7.0 mmol/L和口服75g葡萄糖后2小时血浆糖≥11.1 mmol/L，共166例(男/女为75/91)，年龄(56±10)岁，BMI(26.76±3.67)kg/m²，均为未经治疗的初诊患者。

2.从法国人类多态研究中心(CEPH)提供的参照家系库中选取无亲缘关系的正常白种人配偶33对，共66例(男/女为33/33)。

二、方法

1.BMI测定：脱鞋及穿内衣，测身高及体重，BMI=体重(kg)/身高²(m²)。

2.糖脂代谢测定：给予75g葡萄糖口服，于0，30，60，120及180分钟分别测血糖(酶法)，胰岛素(放免法)，C肽(放免法)及游离脂肪酸(酶法)。还测定空腹脂代谢谱：总胆固醇(TC，酶法)，甘油三酯(TG，酶法)，高密度及低密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C及LDL-C，硫酸葡聚糖-锰沉淀法及公式计算)。

3.胰岛素分泌与胰岛素作用：按稳态模式评估(homeostasis model assessment, HOMA)计算β细胞功能(HOMAB)及胰岛素抵抗(HOMAIR)^〔5〕，糖负荷后变量总值(SUM)为各时值之和；糖负荷后曲线下面积(AUC)按不规则四边形面积公式计算^〔6〕。

4.UCP2基因A/V55变异分析：常规酚/氯仿法抽提外周血基因组DNA，以100ng DNA为模板在总反应体积30μl内行错配PCR扩增^〔7〕：上游引物为5'-GGGCCAGTGCGCGCTGCAG-3'，下游引物为5'-CATTTGGCGCTGCAGGCCGG-3'(由CyberSyn公司合成)，PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，66℃退火及延伸2分钟，共30循环；最后进一步延伸72℃10分钟；反应在DNA热循环仪上进行(Perkin-Elmer 9600型)，扩增产物为126bp，经2%琼脂糖电泳确认扩增结果后，继以限制性内切酶Bbv I(Bio-Lab公司)在37℃酶解PCR产物12小时，经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(29:1)分离酶解片段，电压150V，1小时，溴化乙锭染色后紫外光下观察：AA纯合子电泳带型为98bp，VV纯合子电泳带型为126bp，AV杂合子电泳带型为126bp及98bp(图1)。

5.统计学分析：运用Hardy-Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性，运用基因计数法计算各组基因型频率及等位基因频率。组间频率比较用χ²检验，组间临床变量比较用ANOVA检验。正态分布变量以x±s表示；偏态分布变量以中位数(25%位数，75%位数)表示，偏态变量在统计学处理前先经自然对数转换。上述数据处理运用SAS软件分析。

图1UCP2基因A/V55变异电泳结果

Fig 1Electrophoresis result of A/V55 variants of UCP2 gene

结果

一、中国人UCP2基因A/V55变异频率分布并与白种人比较

90例NGT且非肥胖(BMI＜25kg/m²)的中国人其AA，AV及VV的基因型频率分别为0.31，0.51及0.18，A及V等位基因频率分别为0.57及0.43，与本研究中66例正常白种人的基因型频率相近似(P=0.615)。两种族基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，其AA、AV及VV基因型频率分别为0.32，0.56，0.12。A及V等位基因频率分别为0.60，0.40。

二、中国人UCP2基因A/V55变异与2型糖尿病的关系

NGT组与2型糖尿病组UCP2基因A/V55变异的基因型频率分布亦相近似(P=0.558)。两组基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。

三、UCP2基因A/V55变异与中国人2型糖尿病葡萄糖兴奋后胰岛素分泌(glucose stimulated insulin secretion, GSIS)的关系

在2型糖尿病组(166例)中发现UCP2基因A/V55变异与葡萄糖负荷后血胰岛素总值(SUMIN)及葡萄糖负荷后胰岛素曲线下面积(AUCIN)相关(P值分别为0.0108及0.0149)，且该基因变异与中国人2型糖尿病HOMAβ细胞功能相关(P=0.0174)。相似的趋势亦见于葡萄糖负荷后C肽值的变化(表1)。

四、UCP2基<