关键词： 葡萄糖转运蛋白1；大黄酸；转化生长因子β1；肾小球系膜细胞

【摘要】目的研究大黄酸对系膜细胞葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)及葡萄糖摄入的影响，探讨大黄酸拮抗TGFβ1作用的可能机制。方法选用体外培养的小鼠肾小球系膜细胞，GLUT1 mRNA表达的检测采用Northern印迹，葡萄糖摄入的测定采用2-deoxy-〔³H〕-D-glucose摄入法。结果TGFβ1显著增加系膜细胞GLUT1 mRNA的表达和葡萄糖摄入，大黄酸对正常培养条件下系膜细胞的葡萄糖摄入没有明显影响，但可以拮抗TGFβ1增加系膜细胞GLUT1 mRNA表达与葡萄糖摄入的作用。结论TGFβ1介导系膜细胞葡萄糖代谢的改变以及细胞外基质合成的增加，大黄酸能明显抑制TGFβ1所引起的系膜细胞GLUT1表达与葡萄糖摄入的异常增高。

Effect of rhein on glucose transporter-1 expression and glucose uptake in mouse glomerular mesangial cells cultured in vitro

ZHANG Jing,LIU Zhihong,LI Yingjian,et al.

Research Institute of Nephrology,Jinling Hospital,Nanjing University, School of Medicine,Nanjing,210002

【Abstract】ObjectiveTo explore the possible molecular mechanism that rhein antagonizes the effect of TGFβ1 on glomerular mesangial cells.MethodsCultured C57/SJL mouse mesangial cells were used in the in vitro study. The expression of glucose transporter 1 (GLUT1) mRNA was detected by Northern blot and the ability of glucose uptake was determined by 2-deoxy-〔³H〕-D-glucose uptake assay.Results Rhein had no effect on glucose uptake in mesangial cells cultured in normal glucose concentration. TGFβ1 could upregulate the expression of GLUT1 mRNA and gucose uptake in mesangial cells and this effect was markedly attenuated by the addition of rhein in a dose-dependent manner.ConclusionTGFβ1 could upregulate the expression of GLUT1 mRNA and glucose uptake in mesangial cells, leading to excessive glucose consumption and extracellular matrix production in diabetic nephropathy. Rhein antagonized the effect of TGFβ1 in mesangial cells.

【Key words】Glucose transporter 1RheinTransforming growth factor β1Glomerular mesangial cells

大部分哺乳动物细胞是以葡萄糖作为其主要的能量来源，葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1，GLUT1)是细胞膜上一种重要的葡萄糖载体分子，介导葡萄糖通过易化扩散由膜外转运至细胞内，直接调节细胞的糖代谢^〔1〕。

系膜细胞代谢异常与细胞外基质(extracellular matrix, ECM)合成增加是糖尿病肾病中肾小球硬化形成的关键因素^〔2〕，GLUT1是肾小球系膜细胞主要的葡萄糖转运体，GLUT1在系膜细胞的过度表达使得过多的葡萄糖进入细胞，引起细胞糖代谢的紊乱，进而导致细胞外基质合成增加^〔3，4〕。转化生长因子β1(TGFβ1)在糖尿病肾病的发生及发展中起重要作用，TGFβ1可以上调系膜细胞GLUT1的表达与葡萄糖的摄入^〔5〕，因此，抑制TGFβ1介导的GLUT1在系膜细胞的过度表达是预防与治疗糖尿病肾病重要途径。

大黄酸(rhein， 4,5 dihydroxyanthraquinone-2-carboxylic acid)是中药大黄的一种主要成份，动物实验表明中药大黄及其提取物大黄酸可以抑制糖尿病大鼠肾脏的高代谢，明显减少尿蛋白，控制肾脏的肥大，但其作用机制并不清楚^〔6，7〕。体外实验显示大黄酸可以抑制肿瘤细胞葡萄糖的摄入，影响其能量供应，而且大黄酸对系膜细胞的增殖也有抑制作用^〔8，9〕。

为了研究大黄酸对糖尿病状态下系膜细胞糖代谢可能的影响，我们分别观察了大黄酸对正常培养条件下和TGFβ1刺激下系膜细胞GLUT1表达及葡萄糖摄入的影响。

材料和方法

一、材料

大黄酸由本研究所从中药大黄中提取，纯度大于95%；DMEM(低糖)购自Sigma公司；小牛血清购自四季青生物工程研究所；TGFβ1购自Promega公司；GLUT1 cDNA探针由美国华盛顿大学Mueckler博士惠赠；随机引物标记试剂盒来自Promega公司；2-deoxy-〔³H〕-D-Glucose购自Amersham公司。

二、系膜细胞培养

本实验采用的系膜细胞是从四周龄C57B1/6J×SJL/J小鼠肾小球分离克隆的系膜细胞系。所有实验均控制在25～35代细胞中进行。细胞在DMEM培养液中培养传代(20%小牛血清)。

三、RNA提取与Northern印迹

选70%融合的系膜细胞，用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA，取30μg RNA在含2.2mol/L甲醛的1%琼脂糖中电泳，毛细管法转印至尼龙膜上，80℃固定两小时，在预杂交液(5×SSPE，50%甲酰胺，5×Denhardt's液, 0.1%SDS,100μg/ml鲑鱼精子DNA)中42℃预杂交4小时，在含³²P标记cDNA探针的杂交液(5×SSPE,50%甲酰胺，0.1%SDS，100μg/ml鲑鱼精子DNA)中42℃杂交18小时，2×SSC，0.1%SDS溶液室温洗三次，0.2×SSC，0.1%SDS溶液55℃洗一次，对X光片-70℃曝光48小时。GLUT1探针标记采用随机引物法。

四、系膜细胞葡萄糖摄入测定

系膜细胞接种二十四孔板中生长至70%融合，弃培养液，用20mmol/L HEPES(140mmol/L NaCl,1mmol/L CaCl₂,5mmol/L KCl,2.5mmol/L MgSO₄,20mmol/L HEPES,0.1%BSA,pH 7.4)洗三次，加入1ml 1μCi/ml 2-deoxy-〔³H〕-D_Glucose的HEPES液，37℃半小时，PBS洗三次，加1mmol/L NaOH作用两小时，盐酸中和至中性，加闪烁液5ml，液闪仪计数其cpm值。蛋白质浓度测定采用考马斯亮兰G250法。

结果

一、大黄酸对生理葡萄糖浓度培养条件下系膜细胞葡萄糖摄入的影响

系膜细胞在生理葡萄糖浓度培养条件下生长至亚融和状态，分别加入50μg/ml和25μg/ml的大黄酸培养24小时，发现大黄酸对系膜细胞葡萄糖摄入无明显影响，与对照组葡萄糖摄入率(100%)相比则分别为90.39%及95.84%。

二、TGFβ1对肾小球系膜细胞葡萄糖摄入的影响

系膜细胞70%融合，用含1%血清培养液处理24小时，分别加0.5ng/ml,1.0ng/ml和2.0ng/ml的TGFβ1至1%血清的培养液中继续作用10小时，并以1%血清为对照，发现TGFβ1能显著增加系膜细胞葡萄糖摄入，以对照组摄入为1，则加0.5 ng/ml,1.0ng/ml,2.0ng/ml，各组葡萄糖摄入为2.82，2.87，4.28，其作用呈剂量依赖关系。

图1大黄酸对TGFβ1增加肾小球系膜细胞葡萄糖摄入的影响

Fig 1Rhein attenuated the effect of TGFβ1 on glucose uptake of mesangial cells

选择在DMEM-1%血清中培养的系膜细胞为对照，观察2ng/ml TGFβ1作用10小时(T)，及2ng/ml TGFβ1再分别加20μg/ml大黄酸(T+R20)和50μg/ml大黄酸(T+R50)作用10小时后系膜细胞糖摄入，发现50μg/ml大黄酸可以拮抗TGFβ1的作用The mouse mesangial cells grown in medium of DMEM containing 1% fetal serum were selected as normal control and cells were seeded and grown for 24 hours in standard medium (20% serum) and switched to medium containing 1% serum for 24 hours, then incubated in this medium for 10 hours with one of the following: 2ng/ml TGFβ1 (T), 2ng/ml TGFβ1 plus 20μg/ml rhein (T+R20), or 2ng/ml TGFβ1 plus 50μg/ml rhein (T+R50). Finally, 2-Deoxy-〔³H〕-D-glucose uptake rate was measured

三、大黄酸对TGFβ1增加肾小球系膜细胞葡萄糖摄入的影响

为了研究大黄酸对TGFβ1作用的影响，我们在加入2ng/ml TGFβ1的同时分别加入20μg/ml和50μg/ml的大黄酸，结果大黄酸显著抑制TGFβ1对肾小球系膜细胞葡萄糖摄入的上调作用(图1)。

四、大黄酸对TGFβ1增加肾小球系膜细胞GLUT1 mRNA表达的影响

进一步研究大黄酸拮抗TGFβ1的机制，发现50μg/ml大黄酸可明显抑制TGFβ1增加GLUT1 mRNA表达的作用(图2)。

图2GLUT1 mRNA Northern分析

Fig 2Northern analysis of GLUT1 mRNA expression in mesangial cells

选择DMEM-1%血清中培养的系膜细胞为对照(泳道1)，观察2ng/ml TGFβ1作用10小时(泳道2)，及2ng/ml TGFβ1再加50μg/m