关键词： 谷氨酸脱羧酶；纯化；糖尿病，1型；凝胶层析

【摘要】目的从猪脑中提取纯化谷氨酸脱羧酶(GAD)，用于1型糖尿病患者GAD抗体的测定。方法以猪脑制备GAD粗酶，经Sephadex G100、DEAE-Sephacel和羟基磷灰石凝胶层析分离纯化，结合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定相对分子质量、同位素法测定GAD酶活性，建立了GAD纯化方法。结果GAD粗酶经纯化后的单位蛋白量的酶活性增加了118倍。经SDS-PAGE分析，为一条相对分子质量约64000的蛋白条带。结论用多步层析分离法从猪脑中提取纯化GAD是一种简便可行的方法。

Purification and identification of glutamic acid decarboxylase from porcine brain

YANG Jinkui,CHEN Jiawei,HE Ronghua.

Department of Endocrinology,the First Affiliated Hospital,Nanjing Medical University,Nanjing,210029

【Abstract】ObjectiveTo purify glutamic acid decarboxylase (GAD) from porcine brain for the sake of detecting GAD antibodies in patients with type 1 diabetes mellitus.MethodsGAD was obtained from porcine brain as a crude extract and purified by using Sephadex G100, DEAE-Sephacel and calcium phosphate chromatography. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and GAD activity assay were adopted to identify this purified enzyme.ResultsWith this method, specific activity of GAD increased by 118-fold and it consisted of a single band around 64000 on SDS-PAGE.ConclusionIt is a simple and useful method to purify GAD from porcine brain by multi-step chromatography.

【Key words】Glutamic acid decarboxylasePurificationDiabetes mellitus, type 1Gel chromatography

1型糖尿病是一种自身免疫性疾病。患者血清中可存在多种与1型糖尿病发病有关的自身抗体。其中，64kD抗体(群)(64kD antibodies, 64kAs)，谷氨酸脱羧酶(GAD)抗体对于1型糖尿病的预测及早期诊断和鉴别诊断具有重要的临床应用价值^〔1〕。1990年证实，64kD蛋白为GAD^〔2〕。GAD是合成一种抑制性神经递质的限速酶，在体内催化谷氨酸转化为γ-氨基丁酸。在脑、胰腺等组织均有大量分布^〔3〕。为制备GAD抗体测定试剂盒，我们以猪脑制备GAD粗酶，经凝胶层析分离纯化，结合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)测定分子量、同位素法测定GAD酶活性的鉴定方法，建立了GAD纯化方法，现将结果报道如下。

材料和方法

一、材料

聚丙烯酰胺(丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺)为德国Fluka公司产品。L-1-¹⁴C-谷氨酸为Amerash公司产品。SDS、Sephadex G100、磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate, PLP)、溴化氨乙基异硫脲(aminoethyliso-thiouronium, AET)均为Sigma公司产品。羟基磷灰石为华美生物工程公司产品。DEAE-Sephacel为瑞典Pharmacia公司产品。

二、方法

1.GAD鉴定方法：(1)SDS-PAGE测定分子量：采用Laemmli法，4%的浓缩胶和10%的分离胶。抗原溶液加入等体积的样品缓冲液(10mmol/L pH 7.2磷酸钠缓冲液，5% β-巯基乙醇，1%SDS)，煮沸3分钟，样品加入到1mm厚凝胶样品槽中，以10mA恒流条件下电泳5小时。(2)GAD酶活性分析：酶反应按文献^〔4〕改良进行，10μl 40mmol/L谷氨酸(含0.1μCi L-1-¹⁴C-谷氨酸)于自制反应试管中^〔5〕，加入90μl酶溶液，于37℃反应30分钟，加20μl 1mol/L H₂SO₄终止反应，并继续在37℃下保温1小时，使产生的¹⁴CO₂完全释放并吸附到涂有海胺(Sigma)的滤纸片上，待反应完成，取出滤纸片于测量瓶加3ml闪烁液(Hisafe Pharmacia)，用液闪计数仪(Wallac 1409， Pharmacia)测定cpm值。(3)蛋白含量分析：采用考马斯亮兰比色法。

2.GAD纯化步骤：(1)制备GAD粗制品：猪6只，宰杀后立即取出全部脑组织，去除脑干，剪成极小的组织块，加入10倍体积的标准缓冲液(含50mmol/L磷酸钾，0.2mmol/L PLP，1.0 mmol/L AET, pH 7.2)，4℃条件下高速匀浆机匀浆，130000×g离心60分钟，取上清作为GAD粗制品，用于进一步纯化。(2)硫酸铵盐析：取GAD粗制品，逐步加入27%饱和硫酸铵溶液，同时加入0.1 mol/L NH₄OH使pH值保持在7.2左右。混匀15～20分钟，4℃条件下130000×g离心30分钟，取上清加入62%饱和硫酸铵溶液，同时加入0.1 mol/L NH₄OH使pH值保持在7.2左右。沉淀溶于标准缓冲液，并用标准缓冲液透析硫酸铵。(3)Sephadex G100凝胶柱层析：Sephadex G100凝胶柱体积4.0×60cm，加入40ml(约1000mg蛋白量)盐析后的GAD粗制品。用标准缓冲液洗脱，流速25ml/hr，分部收集洗脱蛋白。渗透压法浓缩洗脱物(将洗脱物装入透析袋中，置透析袋于平的表面上，将聚乙二醇20000干粉撒于其上，至浓缩到所需的体积)。SDS-PAGE测定分子量。取相对分子质量64000条带明显的收集物，硫酸铵盐析，取30%～68%硫酸铵盐析蛋白，测定GAD酶活性，并作进一步纯化。(4)DEAE-Sephacel凝胶柱层析：DEAE-Sephacel凝胶柱体积2.5cm×50cm，加入20ml经(3)纯化后的GAD溶液。用标准缓冲液洗脱，丢弃洗脱物。再用150mmol/L磷酸钾缓冲液(含0.2 mmol PLP,1.0mmol/L AET,pH 7.2)洗脱，收集洗脱蛋白。渗透压法浓缩洗脱物，SDS-PAGE测定分子量。硫酸铵盐析，取33%～70%硫酸铵盐析蛋白，测定GAD酶活性，并作进一步纯化。(5)羟基磷灰石凝胶柱层析：羟基磷灰石凝胶柱体积2.5cm×50cm，加入20ml经(4)纯化后的GAD溶液。用标准缓冲液洗脱，用25mmol/L磷酸钾缓冲液洗脱，丢弃洗脱物。再用标准缓冲液和75、150mmol/L磷酸钾缓冲液洗脱，分别收集洗脱蛋白。渗透压法浓缩洗脱物，SDS-PAGE测定分子量。测定GAD酶活性。

结果

GAD粗制品经Sephadex G100凝胶柱层析产生两个蛋白峰，结果如图1。第一峰为穿透峰，第二峰为排阻峰。

第二峰分部收集后SDS-PAGE结果如图2。排阻峰管号35、40、45的64000蛋白条带最为明显。取35～45管洗脱物混匀后作进一步纯化。

经2(3)纯化后的GAD溶液再经DEAE-Sepha-cel凝胶柱层析，收集洗脱物，SDS-PAGE结果如图3。

经2(4)纯化后的GAD溶液再经羟基磷灰石凝胶柱层析，不同离子强度磷酸钾缓冲液洗脱，收集洗脱物，SDS-PAGE结果如图4。经以上各步纯化过程，GAD溶液的总体积、总蛋白量、总酶活性及特异性酶活性(单位蛋白量的酶活性)如表1。

结果表明，经纯化后的GAD单位蛋白量的酶活性增加了118倍。经SDS-PAGE分析，为一条相对分子质量约64000的蛋白条带。

图1Sephadex G100蛋白分离洗脱曲线

Fig 1Elution curve of proteins separated by Sephadex G100

图2Sephadex分离后的SDS-PAGE

Fig 2SDS-PAGE analyses of proteins after Sephadex sparation

图3DEAE-Sephadex凝胶分离后的SDS-PAGE蛋白分析

Fig 3SDS-PAGE analyses of proteins after DEAE-Sephacel gel separation

图4羟基磷灰石凝胶分离后的SDS-PAGE蛋白分析

Fig 4SDS-PAGE analyses of proteins after calcium phosphate gel sparation

讨论

免疫标志特别是GAD抗体的检测是预测1型糖尿病的重要方法同时也有助于1型糖尿病病因的诊断。高纯度GAD抗原制备是GAD抗体研究的关键。然而，GAD有多种类型的同功酶^〔6〕，这给GAD纯化带来了困难。通过测定GAD酶活性发现，GAD不仅存在于脑和胰岛，也存在于肾、肝、垂体、甲状腺、肾上腺、睾丸和卵巢。有趣的是只有从脑和胰岛提取的GAD能够被1型糖尿病患者血清识别。另外，与1型糖尿病有关的主要为GAD₆₇和GAD₆₅(特别是前者)，两者均存在于哺乳动物的脑和胰岛，相对分子质量均在64000附近^〔6〕。故我们采用猪脑提取GAD。

表1猪脑GAD纯化过程与结果

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