关键词： 苯那普利；糖尿病肾病；p21CIP1蛋白；转化生长因子β1

【摘要】目的研究苯那普利对糖尿病大鼠肾皮质p21^CIP1蛋白表达的调节及其机制。方法大鼠随机分单侧肾切除对照组、糖尿病组及糖尿病苯那普利(10mg^.kg^-1.日^-1，灌胃)治疗组。应用Northern杂交检测各组肾皮质转化生长因子β1(TGFβ1)mRNA表达，Western杂交检测各组肾皮质TGFβ1及p21^CIP1蛋白的表达。另外，血浆、肾皮、髓质血管紧张素转换酶(ACE)活性由荧光分光光度法测定。结果糖尿病大鼠一周后体重即明显下降(P＜0.05)，伴肾重/体重明显增加(P＜0.05)，血浆ACE活性有所下降而肾皮质ACE活性则有所上升。Northern杂交表明糖尿病组肾皮质TGFβ1 mRNA表达约比对照组上升63.6%。肾皮质TGFβ1及P21^CIP1蛋白表达也明显增加；苯那普利治疗一周对肾脏肥大有明显的抑制作用，对血浆、肾皮、髓质ACE活性抑制分别达89.0%、70.0%、70.5%，对肾皮质TGFβ1 mRNA及TGFβ1和p21^CIP1蛋白表达抑制分别达47.7%，49.5%，60.0%。结论苯那普利可抑制糖尿病肾脏早期p21^CIP1蛋白高表达，其机制可能部分与高调TGFβ1表达有关。

Regulation of renal cortex p21^CIP1protein expression by benazepril and its mechanism in diabetic rats

LIN Shanyan,WU Yonggui,YU Yi,et al.

Division of Nephrology,Hua Shan Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai,200040

【Abstract】ObjectiveTo investigate the regulation of renal cortex p21^CIP1 protein expression by benazapril and its mechanism in diabetic rats.MethodsThe rats were randomly divided into following groups: uninephrectomized rats, streptozotocin-induced diabetic rats and diabetic rats treated with benazepril (10mg^.kg^-1.d^-1, by gavage). Angiotensin converting enzyme (ACE) activities were determined by fluorimetric assay in plasma and renal cortex and medulla. Renal cortex transforming growth factor β1 (TGFβ1) mRNA expression was assessed by Northern blot analysis, and TGFβ1 and p21^CIP1protein expression was measured by Western blot analysis.ResultsAfter 1 week, diabetic rats developed a body weight loss, an increased kidney weight/body weight and an elevated ACE activity in renal cortex despite a decreased ACE activity in plasma. Northern blot analysis showed that renal cortex TGFβ1 mRNA expression in diabetic rats increased by 63.6%, as against uninephrectomized rats. Western blot analysis noted that TGFβ1 and p21^CIP1 protein expression was also increased. Administration of benazepril for one week could significantly suppress kidney hypertrophy and ACE activities were reduced by 89.0%, 70.0% and 70.5% in plasma and renal cortex and medulla, respectively. Expressions of TGFβ1 mRNA, TGFβ1 and p21^CIP1 protein were decreased by 47.7%, 49.5% and 60.0%, respectively.ConclusionBenazepril may suppress increased p21^CIP1 protein expression in diabetic rats and its mechanism may partially be related to down-regulation of TGFβ1 expression.

【Key words】BenazeprilDiabetic nephropathyp21^CIP1 proteinTransforming growth factor β1

血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)对糖尿病肾病(DN)的保护作用已为大量的临床和实验所证实，其机制除血流动力学效应外，更重要的是对肾脏肥大的抑制作用。然而，ACEI对糖尿病肾脏肥大抑制作用机制目前尚未完全了解。近年来研究表明糖尿病肾脏肥大受许多细胞因子特别是转化生长因子β₁(transforming growth factor β₁, TGFβ₁)调节，而这些生长因子又是通过调控细胞周期起作用，p21^CIP1蛋白是一种重要的细胞周期蛋白激酶抑制剂(cyclin kinase inhibitor, CKI)，研究表明TGFβ₁的部分作用是通过p21^CIP1蛋白介导^〔1〕。因而，甚有必要了解ACEI是否是通过调节p21^CIP1蛋白表达而抑制肾脏肥大。为此，本研究选用一种对肾组织高度亲和力的ACE抑制剂苯那普利，探讨它对糖尿病大鼠肾皮质p21^CIP1表达的影响及其机制。

材料和方法

一、糖尿病模型建立及动物分组

所有大鼠均接受右侧肾切除术，2周后除6只作对照外，其余均腹腔注射单剂量链脲佐菌素(STZ)60mg/kg(溶解在10mmol/L枸椽酸缓冲液中，pH 5.5)，对照组仅注射等量枸椽酸缓冲液，48～72小时后尾静脉采血，用血糖仪One Touch Ⅱ型〔强生(中国)有限公司〕测定全血血糖，血糖≥16.7 mmol/L，同时尿糖在～以上者确定为糖尿病模型。动物分三组：(1)单侧肾切除对照组(C组，6只)；(2)糖尿病组(D组，7只)；(3)糖尿病苯那普利治疗组(DB组，7只)。苯那普利10mg·kg^-1.d^-1灌胃，C与D组仅给予等量生理盐水灌胃。观察一周后收集标本。

二、标本收集

一周末大鼠在空腹16小时后尾静脉采血待测血糖及血胰岛素水平。然后在3%水合氯醛麻醉下行右侧颈总动脉插管接血压监测仪(XY-1型，长江测试技术服务公司制造)记录平均动脉压(MAP)并收集血标本，取血浆保存于-70℃冰箱中待测ACE活性，同时收集血清待测血肌酐；肾脏在腹主动脉插管后注入4℃预冷的生理盐水反复灌洗后，称重、分离皮、髓质，保存于-70℃冰箱中待测肾组织ACE活性及总RNA和蛋白提取。血糖、血肌酐水平由日立7150型全自动生化分析仪测得；血胰岛素用放射免疫法测定。

三、血浆及肾皮、髓质ACE活性测定

参考Unger^〔2〕等方法略加改进，由日立F-4000荧光分光光度计测得(EX360nm、EW486nm)。所需底物马尿酰-组氨酰-亮氨酸(Hippury-L-histidyl-L-leucine, Hip-his-leu)、荧光激发物邻苯二醛(Ophthadialdehyde)及标准品组氨酰-亮氨酸(His-leu, HL)均购自Sigma公司。酶活性单位表示为nmol HL·min^-1.ml^-1(血浆)或nmol HL·min^-1.mg^-1(组织)。

四、Northern杂交检测肾皮质TGFβ₁ mRNA表达

采用异硫氰酸胍一步法提取肾皮质总RNA，取总RNA 30μg经1%甲醛变性凝胶电泳后，毛细血管法转移至尼龙膜，经紫外线(波长254nm)交联5分钟后置80℃干烤箱中60分钟，42℃预杂交过夜，随机引物法标记探针，42℃杂交24小时，经洗膜后置-70℃冰箱进行放射自显影。除用TGFβ₁ cDNA探针(985bp, HindⅢ/Xba I片段，美国Qian Wensu博士惠赠)进行杂交外，所有样膜经洗脱探针后再用β-actin cDNA探针(870bp, EcoR I片段，上海医科大学生理教研组李新波博士惠赠)再杂交，作为内参照以校正RNA上样量。最后用IBAS-2000图像分析系统对全部杂交信号进行光密度(A值)扫描。

五、Western杂交检测肾皮质TGFβ₁及p21^CIP1蛋白表达

肾皮质组织总蛋白提取采用细胞裂解液RIPA(50mmol/L Tris-HCI,pH 7.2, 10mmol/L EDTA,pH 7.2, 0.1%SDS,1%sodium deoxycholate, 1%Triton X-100,0.6mmol/L PMSF,100U/ml Trasylol,2μg/ml Leupeptin,100μmol/L sodium orthovanadate)。肾皮质组织总蛋白含量按改良Lowry法测定。取总蛋白50μg，加等量样本处理液，100℃煮沸4分钟，15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转移至硝酸纤维素膜上，在丽春红染液中染色观察蛋白转移情况并标出蛋白质分子量标准，然后用含5%脱脂牛奶的TBST封闭，4℃过液，洗膜后加兔抗TGFβ₁及p21^CIP1多克隆抗体(工作浓度1:100，购自Santa Cruz公司)进行杂交，再度洗膜后加辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗免IgG(工作浓度1:100，购自华美生物工程公司)进行二抗杂交，洗膜后加入免疫印迹化学发光试剂(购自华美生物工程公司)，最后进行放射自显影，所有杂交信号在IBAS-2000图像分析系统进行光密度(A值)扫描。

六、统计学处理

数据以±s表示，组间差异性比较采用方差分析和q检验。

结果

一、一周后各组血糖、血胰岛素及血肌酐水平的变化

与对照组相比，糖尿病大鼠血糖明显升高伴血胰岛素水平明显下降(P＜0.01)，提示糖尿病模型建立成功。苯那普利治疗一周对血