糖尿病心肌病变和微血管病变是糖尿病患者心力衰竭和心源性猝死发病率高的病理基础，参与病变的影响因素较多，除糖尿病直接的糖、脂肪代谢紊乱影响外，心肌局部多种血管、神经、内分泌代谢因素也不同程度介入了病变过程。近年来对血管紧张素-Ⅱ(Ag-Ⅱ)在高血压、心肌梗塞后心室重建中的作用及血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)对心脏的保护作用多有研究。本文对实验性糖尿病大鼠心肌Ag-Ⅱ含量和Ag-Ⅱ受体(AT1)mRNA的表达进行了研究。

一、材料和方法

1.实验动物及糖尿病大鼠模型的制备：选用8周龄Wistar雄性大鼠(体重250～300克)20只，随机分为糖尿病组(DM组)和正常对照组(N组)，每组各10只。DM组大鼠经尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)45mg/kg，STZ注射48小时后测定随机血糖(全血法)，2次＞350mg/dl为糖尿病大鼠。正常组大鼠同时经尾静脉注射生理盐水，注射后血糖均小于140mg/dl。各组大鼠均给标准饲料分笼喂养，每两周监测空腹血糖。

2.实验步骤：糖尿病大鼠模型制备完成后6周，开始分组喂养，共12周。糖尿病大鼠不用胰岛素治疗，12周后称量体重，麻醉下开胸取出全心组织，用4℃ 0.02% DEPC水清洗去水后称重，随即放入液氮速冻，全部标本取完后移至-80℃冰箱中保存待用。

3.心脏组织检测项目及方法：(1)心肌组织Ag-Ⅱ含量测定：取左心室游离壁心肌约100mg，加入0.1mol/L醋酸1ml研磨离心制备成组织匀浆液，用Ag-Ⅱ放免试剂盒(由北方免疫试剂研究所提供)测定心肌组织匀浆液中Ag-Ⅱ含量，匀浆液经考马思亮兰法标定蛋白含量，心肌组织Ag-Ⅱ含量用pg/mg蛋白表示。(2)心肌组织AT1 mRNA表达：另取大鼠左心室游离壁心肌约100mg按非超离心一步法^〔1〕提取心肌组织总RNA。取其中1μg，应用RT-PCR方法进行RT-PCR反应。PCR的AT1引物序列^〔2〕分别为：5’-CCAAAGTCACCTGCATCATCATC-3'，5'-CACAATCGCCATAATTATTCCTA-3'，扩增305bp cDNA片段，同时扩增大鼠肌动蛋白，引物序列^〔3〕分别为：5'-CCGCCCTAGGCACCAGGGTG-3'，5'-GGCTGGGGT-GTTGAAGGTCTCAAA-3'，扩增286bp cDNA片段，作为阳性对照(引物由中国科学院微生物研究所合成)。用生理盐水取代cDNA作为阴性对照。PCR变性、退火和延伸温度分别为94℃、55℃和72℃，反应时间分别为45秒、45秒、60秒，共进行30个循环。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析，电泳后在紫外灯下拍摄照片，照片中不同PCR产物的条带，用德国徕卡图像光密度分析仪(Leicaq550)，进行半定量分析。结果用大鼠心肌组织AT1的PCR产物光密度积分值/大鼠心肌组织肌动蛋白PCR产物光密度积分值的比值表示。

4.统计学处理：各组检测项目结果用±s表示，组间比较用t检验。

二、结果

1.各组大鼠体重及心脏重量：可见DM大鼠体重和心重均低于正常对照组，但心重/体重比值N组高于DM组(P＜0.05)。

2.大鼠心脏组织Ag-Ⅱ含量测定结果：N组、DM组心脏组织Ag-Ⅱ含量分别为63.68±19.23，78.08±17.65，DM组明显高于N组，差异有显著性意义P＜0.05。

3.大鼠心肌组织AT1的mRNA表达：经RT-PCR产物电泳后紫外光摄片显示，DM组电泳条带亮度强于N组。光密度积分比值半定量分析结果提示，糖尿病大鼠心肌组织中AT1 mRNA表达光密度积分比值显著高于N组，差异有显著性意义(P＜0.001)。

三、讨论

以往人体和动物实验已证实^〔4〕：糖尿病可导致心脏重量增加，心肌细胞肥大，肌纤维断裂，肌丝扭曲，线粒体增多，变性肿胀，心肌内微血管管径变窄，闭塞，可见血小板聚集，超微结构观察可见血管内皮细胞肿胀，基底膜增厚，泡内吞饮明显增多等。病变随着病程延长而逐渐加重，可导致心肌顺应性下降，心室肌舒、缩功能降低。上述病理改变，除微血管病变较特异外，多数并非糖尿病所特有，如高血糖的毒性作用，糖、脂代谢异常引起的能量供应不足、缺氧，血液动力学改变，多种神经、内分泌因素的参与等。近年来，国内对心肌局部肾素-血管紧张素系统(RAS)参与糖尿病心脏病变的研究已有报导^〔5〕。心脏局部存在血管紧张素原(AgN)，血管紧张素Ⅰ(Ag-Ⅰ)，Ag-Ⅱ和ACE等完整的RAS。其中Ag-Ⅱ作为该系统的主要作用因子具有较强的促血管收缩和心脏重量增加及促心肌和血管内皮细胞生长效应^〔6〕。在高血压、心肌梗塞、心力衰竭等心室重塑中起重要作用^〔7-9〕。Ag-Ⅱ通过组织细胞膜的血管紧张素受体(AR)起作用，已知AR分为AT1和AT2、AT4三型，AT1又分为AT1a、AT1b两个亚型，分布在各组织脏器。其中有AT1的细胞为Ag-Ⅱ主要效应细胞，心肌细胞主要含有AT1受体。Ag-Ⅱ的生成除受ACE的影响外，还可由人类胃促胰酶、激肽释放酶、组织蛋白酶G、丝氨酸蛋白酶等多酶系影响转换生成。AT1的基因表达也受Ag-Ⅱ调控，组织Ag-Ⅱ含量增高时，AT1基因表达增高，显示为升调节(Upregulation)。与Ag-Ⅱ作用有关的心室重塑等病理改变可经应用ACEI或AT1受体阻滞剂的治疗减轻^〔10〕。文献中糖尿病心脏病变中Ag-Ⅱ和AT1受体基因表达的关系结果不一^〔11〕。

本文观察STZ-糖尿病大鼠心脏病变中组织Ag-Ⅱ含量、AT1受体基因表达。结果显示，未经胰岛素治疗的STZ糖尿病大鼠在4个月病程时，心重/体重比值增加，心脏组织中Ag-Ⅱ含量DM组高于N组，差异有显著性意义。DM组AT1受体基因mRNA表达亦明显增强，显示为升调节，提示在糖尿病大鼠心肌局部的RAS参与了心脏病变的发生和发展，糖尿病时心脏局部的RAS活性增高，可能与心脏局部微循环血液动力学和细胞内代谢的变化有关^〔12〕。

参考文献

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(收稿：1998-08-06修回：1999-04-21)