关键词： 肥胖；瘦素；分子克隆

【摘要】目的为了获得大量的、可供实验研究和临床应用的人leptin。方法采用基因工程技术，把肥胖基因(obese gene, OB)编码人leptin的cDNA序列(OB1)定向插入高效原核细胞表达载体pBV221，构建重组质粒pBV221OB1，并转化大肠杆菌TG1。结果经过限制性内切酶分析和PCR技术鉴定，重组质粒pBV221OB1含有编码人leptin的基因序列。结论成功的构建了人leptin基因原核细胞表达体系。

Cloning human leptin gene into an E. Coli expression vector

YU Xuemei,ZHU Zhenyu,FU Zuzhi,et al.

Department of Endocrinology,Sun Yat-sen Memorial Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou,510120

【Abstract】ObjectiveTo get human leptin which can be used in experimental study and clinical application.MethodsWith gene engineering technique, human leptin cDNA sequence (OB1) was inserted directly into pBV221, a proeukaryotic cell expression vector, to construct recombinant pBV221OB1 and to transform E. coli strain TG1.ResultsThrough the analysis of restrictive endonuclease and polymerase chain reaction (PCR), recombinant pBV221OB1 contained the cDNA sequence coding human leptin.ConclusionProeukaryotic cell expression system containing the cDNA sequence of human leptin gene was constructed.

【Key words】ObesityLeptinMolecular cloning

(Chin J Endocrinol Metab, 1999,15:172～174)

瘦素(leptin)主要是由脂肪组织分泌的146个氨基酸的激素，其前体是167个氨基酸的蛋白质，N-端21肽是信号肽^〔1〕。Leptin进入血液循环后，与特异性运输蛋白结合，通过血脑屏障，与下丘脑的特异性受体结合，从而把体脂库大小的信号传递给下丘脑，下丘脑通过一系列神经和体液因素调整体脂库的大小，最终控制体重相对恒定^〔2〕。Leptin除了以上中枢作用外，尚有周围作用，如作用于胰岛β细胞，抑制胰岛素的分泌^〔3〕，作用于脂肪等组织，调节物质代谢^〔4〕。近期的研究发现胎盘也分泌leptin，并且leptin与生殖系统的功能有关^〔5〕。自1994年Zhang等对leptin基因进行了分子克隆和序列测定以来，人们对leptin进行了大量研究。但迄今为止，关于leptin的生理作用及其与肥胖、糖尿病关系，尚不完全清楚。为了获得重组表达的leptin，以便深入研究leptin的作用，本研究把人leptin基因(OB1)克隆于高效表达质粒中，构建了含有leptin编码序列的原核表达体系。

材料与方法

一、材料

pUC19OB为本科室构建的重组质粒^〔6〕；TG1为本校寄生虫教研室保存的菌种；pBV221为本校生化教研室保存的质粒；Sal I,EcoR I,HindⅢ,PCR Markers,λDNA Hind Ⅲ+EcoR I Markers为华美生物工程公司产品；Taq DNA聚合酶为上海复华实业公司产品；Nco I为Promega公司产品；T₄ DNA连接酶为Boehringer Mannheim公司产品。PCR引物由上海生物工程公司合成，其序列如下：引物Ⅰ5'-GTCCCCATGGTGCCGATCCAAAAAG-3'(划线部分为Nco I位点)；引物Ⅱ5'-CTTCGTCGAC-TCAGCTCCCAGGGC-3'(划线部分为Sal I位点)。

二、方法

1.PCR引物设计：根据pBV221的多克隆位点和中国汉族人肥胖基因(OB)cDNA翻译leptin的序列，设计引物。引物分别含有Nco I和Sal I酶切位点，使扩增片段除了含有编码leptin的序列外，5'端含有Nco I位点和起始密码子ATG，3'端含有终止密码子TGA和Sal I位点。

2.PCR扩增OB1基因：在20μl终体积的反应体系中，含模板pUC19OB 10ng，引物Ⅰ、Ⅱ各36pmol，Taq DNA聚合酶1U。首先在94℃变性90秒，然后按94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒，共循环30次，最后在72℃延伸5分钟。取5μl扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳(40V,2小时)，经溴化乙锭染色后，在紫外灯下观察，并摄片。

3.目的基因的酶切鉴定：PCR扩增的OB1基因经Hind Ⅲ酶切后，经上述方法2电泳、摄片。

4.酶切、连接和转化：Nco I和Sal I双酶切PCR扩增的OB1基因片段和pBV221，酶切产物进行低熔点琼脂糖凝胶回收，回收产物在T₄DNA连接酶的作用下，将OB1基因定向插入pBV221，构建原核重组表达质粒pBV221OB1，然后转化感受态的大肠杆菌TG1。

5.筛选：挑取抗氨苄青霉素的单菌落进行培养，根据质粒DNA的电泳迁移率进行初步筛选。

6.限制性内切酶分析：把重组质粒pBV221OB1和空载质粒pBV221进行EcoR I和Sal I双酶切和单酶切，观察其电泳结果。

7.采用PCR技术鉴定：以pBV221OB1为模板，用前述特异性引物扩增基因片段，1%琼脂糖凝胶电泳，观察扩增产物的分子量大小。

结果

一、OB1基因的获得

以pUC19OB为模板的PCR扩增产物见图1第三泳道，显示单一扩增带，位于Markers的929bp和383bp之间，与OB1的理论值460bp一致。

图1PCR扩增产物OB1及其酶切鉴定

Fig 1OB1 and its analysis by restrictive endonuclease

M: pBR322 BstN1 markers；1:以pBV221OB1为模板扩增的OB1(460bp)PCR amplification product OB1 applying pBV221OB1 as templates (460bp)；2:以pBV221为模板扩增，未见DNA条带No band was seen by using pBV221 as templates；3:以pUC19OB为模板扩增的OB1(460bp)PCR amplification product OB1 by using pUC19OB as templates (460bp)；4:OB1用HindⅢ酶切后产生两条带(107bp,253bp) OB1 digested with Hind Ⅲ (107bp, 253bp)

二、PCR扩增产物OB1的酶切鉴定

Hind Ⅲ消化的PCR扩增产物OB1见图1第四泳道，显示两条分子量较小的条带，分子量大小分别与理论值107bp和353bp相符。由此可确定该460bp的DNA分子为编码leptin的基因片段。

三、限制性内切酶分析(见图2)

图2限制性内切酶分析

Fig 2Restrictive endonuclease analysis

M:λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ markers；1:pBV221单酶切(EcoR 1) pBV221 digested with EcoR I；2:pBV221OB1单酶切(EcoR I)pBV221 OB1 digested with EcoR I；3:pBV221OB1双酶切(EcoR I and Sall)pBV221OB1 digested with EcoR I and Sal I

用EcoR I消化pBV221，第一泳道显示DNA片段大小为3 666bp，重组质粒pBV221OB1用EcoR I消化，第二泳道显示DNA片段大小为4 102bp，重组质粒pBV221OB1用EcoR I和Sal I双酶切，第三泳道为两个片段，分别与理论值3 651bp和451bp相符。

四、采用PCR技术鉴定(图1)

以pBV221OB1为模板扩增的基因片段与以pUC19为模板扩增的基因片段电泳迁移率相同；以pBV221为模板扩增，未见任何DNA条带。

讨论

动物血液循环中的leptin浓度与体内脂肪量呈正相关^〔7〕。Leptin向中枢神经系统传递信号，从而维持体重相对恒定。遗传性肥胖动物模型缺乏leptin，出现摄食量增加、肥胖、血糖和胰岛素水平升高。给予外源性leptin，上述现象得到纠正^〔8〕。人类缺乏leptin，也出现显著肥胖^〔9〕，但较为罕见。肥胖患者血中leptin水平升高，却不能发挥其作用，其原因尚不清楚。leptin与动物生殖能力也有关^〔10〕，遗传性肥胖动物模型ob/ob小鼠体内缺乏有生物活性的leptin，丧失生殖能力，给予外源性leptin，其生育能力恢复。leptin与胰岛素、下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴存在相互作用^〔11〕，对于葡萄糖、脂肪等的代谢影响，研究结果不一^{〔12，13〕}。Leptin与肥胖、胰岛素依赖型糖尿病的发生、发展有何关系，尚不确定^〔14〕。鉴于国内对于leptin的研究尚少，采用基因工程获得leptin，为进一步研究做好了准备工作。

在原核细胞中高效表达外源基因^〔15〕，首先要有强的启动子，即RNA聚合酶的结合部位，而且这个启动子最好是可以调控的；此外，还需要SD序列，即核糖体结合位点。SD序列的组成及其与起始密码子AUG间的距离，都会显著地影响翻译水平。转录终止序列对稳定宿主载体系统非常重要，因为即使插入片段不含转录终止信号，由此亦可避免发生通读所造成<