关键词： 大鼠；白蛋白；放免测定方法；血管紧张素转换酶抑制剂；尿白蛋白排泄率

【摘要】目的建立大鼠尿白蛋白放免测定方法及其应用意义。方法用大鼠白蛋白免疫青紫蓝兔，制备抗血清，采用双抗加PEG法。结果本方法测定范围25～1 600μg/L，灵敏度为9.78μg/L，回收率89.2%～112.0%，批内、批间平均变异系数分别为4.1%和8.3%。大鼠在糖尿病成模2周时，24小时尿白蛋白排泄率(UAE)升高，而培哚普利治疗组尿白蛋白与正常大鼠组无明显差异，在治疗6个月后尿白蛋白明显低于糖尿病(P＜0.01)，培哚普利能明显抑制糖尿病大鼠尿白蛋白排泄，对糖尿病大鼠肾脏有某种保护作用。结论大鼠尿白蛋白放免测定方法的建立为糖尿病大鼠肾病模型和其他肾病的研究工作提供了一个客观的、灵敏的早期诊断指标。

Establishment of a radioimmunoassay method for urinary albumin excretion and the effect of ACEI on the excretion in rats

WANG Li,PAN Changyu,HUANG Zhaojian,et al.

Department of Endocrinology,Xuan Wu Hospital,Beijing,100053

【Abstract】ObjectiveTo establish a radioimmunoassay method for determination of urinary albumin excretion (UAE) in rats and to evaluate its significance.MethodsThe rabbits were immunized with rat albumin. Rat urinary albumin excretion was determined radioimmunologically with the prepared antiserum and second antibody-PEG technique.ResultsThe measurement range of this second antibody-PEG method was 25～1 600μg/L. Recovery rate and intra- and inter-batch variation coefficients were 89.2%～112.0%, 4.1% and 8.3% respectively. 24h UAE was measured in rats which were divided into three groups: the diabetic controls (DM group), the group treated with Perindopril (DP group) and the normal controls (NC group). The 24h UAE in DC group was elevated at 2 weeks and increased significantly thereafter, whereas there was no significant difference in 24 h UAE between DP and NC groups, suggesting that Perindopril might have some renal protective effects.ConclusionThe establishment of a radioimmunoassay method for UAE might provide a reliable and sensitive means of early diagnosis in experimental diabetic nephropathy.

【Key words】RatAlbuminRadioimmunoassayACEIUAE

(Chin J Endocrinol Metab, 1999,15:164-167)

动物实验已经表明血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)能够减少糖尿病大鼠尿白蛋白的排泄，并且对糖尿病早期由于高滤过引起的微量白蛋白也有作用，而尿白蛋白的排泄率是糖尿病肾病早期诊断指标。但由于国内缺少大鼠白蛋白检测方法，至今尚无有关方面的报道。本文旨在建立大鼠尿白蛋白放免分析方法的基础上，初步探讨培哚普利对糖尿病大鼠尿白蛋白排泄率(UAE)的影响。

材料和方法

一、大鼠尿白蛋白放免分析方法

1.抗血清制备

免疫动物：健康雄性青紫蓝兔4只，兔龄1.0～1.5月，体重1.0～1.5公斤。

免疫方法：首次免疫时，取完全福氏佐剂10ml，加入大鼠白蛋白(rAlb，购自Sigma公司)5mg，充分乳化。将青紫蓝兔背部剪毛，清毒后于背部多点皮内注射，每只兔平均注射2ml。加强免疫用不完全福氏佐剂乳化，rAlb剂量减半，每三周免疫一次，共五次。最后一次免疫后10天，颈内动脉插管放血，分离血清，检测抗体效价，分装后-70℃保存。

抗体效价检测：选择抗体效价最高的4号兔为工作血清，共效价免疫扩散法为1:64倍阳性，放免法1:64 000稀释抗血清的结合率为55%，达到所要求的滴度。应用时用0.05mol/L pH 7.4 PB(磷酸盐缓冲液)内含0.05mol/L EDTA、0.5% BSA(牛血清白蛋白)将大鼠抗血清稀释至1:8×10⁴。

抗血清的亲和常数K：根据K=6YO/(1-YO)(2-YO)(4-YO)(3ED₅₀-ED₂₅)公式^〔1〕，计算出K=3.22×10¹⁰(L/mol)。YO为结合率(以小数表示)，ED₅₀和ED₂₅为B/B₀=50%和25%时的有效剂量(mol/L)。

抗血清特异性：rAlb抗血清与人白蛋白、牛白蛋白、大鼠IgG(800、1 600、8 000、160 000μg/L)分别作交叉试验，结果均为阴性，表明本抗血清对rAlb具有高度的特异性。

2.rAlb放免测定：¹²⁵I-rAlb的制备：采用Iodogen标记法^〔2〕，Iodogen(Sigma公司)10μg溶于50μl二氯甲烷，加入玻璃管底、氮气吹干后，加入脱脂rAlb 50μg/250μl和Na¹²⁵I(国产)1.85MBq/6μl，封口，手摇，室温反应10分钟，加PB 200μl，终止反应。经Sephadex G-50柱(1.0cm×4.0cm)层析，收集¹²⁵I-rAlb峰。鉴定免疫活性合格后分装，-40℃中保存。应用时稀释至1.1～1.2万cpm/100μl。

二、培哚普利治疗分组

1.糖尿病大鼠模型的建立：选择250g左右成年雄性Wistar大鼠，用STZ方法建立糖尿病大鼠模型，血糖≥13.8mol/L列为糖尿病大鼠。

2.实验分组及治疗：自糖尿病形成第三天开始，采用长效胰岛素(PZI，丹麦NOVO公司)经生理盐水稀释后皮下注射，2周后按随机方法将糖尿病大鼠分成2组，即糖尿病大鼠组(DM组)和培哚普利治疗组(DP组)。DM组单用胰岛素治疗，根据血糖及糖尿病情况给予PZI 1～4U/日。DP组PZI用法与DM组完全相同，另外应用培哚普利(法国施维雅药厂)剂量为1mg·kg^-1.d^-1〔3〕，经灌胃给药。正常对照组(NC组)鼠龄、体重均与糖尿病大鼠一致，用等体积生理盐水代替PZI作皮下注射，1次/日。

3.标本采集：于糖尿病形成后15天，即治疗前(0)及治疗后1、3、6个月分别用代谢笼饲养，收集24小时尿标本，离心3 500rpm，15分钟后取上清，经叠氮钠处理后，置于-30℃冰箱中保存待测，并采用上述放免方法进行尿白蛋白检测。试验结束时在乙醚麻醉下，取球后静脉血1.5ml，测定血糖、糖化血红蛋白(HbA₁c)、肌酐、BUN。由于标本采集技术原因，各时段、组别血尿标本例数不尽相同。

三、统计学处理

所有数据用平均数±标准误(±)表示，采用方差分析、Q检验进行统计学处理。

结果

一、大鼠尿白蛋白放免分析方法的方法学鉴定

1.标准曲线：采用双管测定，以Logit B/B₀为纵坐标，标准浓度的自然对数为横坐标绘制标准曲线，连续测定十条标准曲线呈直线回归(图1)。

图1rAlb标准曲线(±s)

Fig 1rAlb standard curves (±s)

经回归计算：Logit Y=5.243-LogX，r=0.997

样本用PB作1:10～1:200稀释，尿中白蛋白含量计算按公式：尿白蛋白含量=稀释倍数×尿量(L)×X，X为尿样的实测值。

2.灵敏度：以一次测定10管B₀均值±2s结合率所相当的剂量表示，本方法灵敏度为9.78μg/L。

3.精密度：对不同浓度的三份样品各取10管做重复测定，求其批内变异系数，高、中、低浓度样品批内变异系数分别为6.1、3.9、2.2，平均为4.1；并于不同时间将上述3种不同浓度样品重复测定10次，求其批间变异系数，高、中、低浓度样品批间变异系数分别为5.7、7.7、11.7，平均为8.3。

4.回收率：用一个已知较低浓度样品进行稀释，将rAlb分别配制成50、500、800μg/L，测定回收率。所测结果分别为97.2%、106.6%、89.2%，平均(97.6±5.0)%。

5.平行试验：将一份高值的尿样品用0.05mol/L PB做倍比稀释，以各自的结合率为纵坐标，以浓度为横坐标，在半对数纸上作图(图2)。

图2平行实验

Fig 2Parallel test

图2显示：稀释曲线与标准曲线平行良好。

6.方法的稳定性：