关键词： 糖尿病脑病；Tau蛋白；超磷酸化；小鼠

【摘要】目的研究糖尿病小鼠脑内Tau蛋白是否过度磷酸化并观察APP17肽的作用。方法用链脲佐菌素诱发小鼠糖尿病模型，并皮下注射APP17肽对糖尿病小鼠进行保护。4周后，取脑组织做AT-8、Tau-1、PP-2B及用PP-2B脱磷酸后的Tau-1免疫组化染色。结果糖尿病小鼠脑内AT-8阳性反应神经元数目多，胞浆和突起深染，而正常小鼠及APP17肽保护的糖尿病小鼠脑内阳性反应神经元数目少，染色淡；糖尿病小鼠海马内PP-2B阳性反应神经元数目比正常小鼠明显减少，用APP17肽保护后染色结果与正常小鼠接近。结论糖尿病小鼠脑内出现Tau蛋白的过度磷酸化，即在丝氨酸202/苏氨酸205位点被磷酸化，PP-2B表达减少可能是导致Tau蛋白过度磷酸化的主要原因。用APP17肽可使PP-2B表达正常而保护Tau蛋白不被过度磷酸化。

On the mechanism of Tau protein hyperphosphorylation

in brain tissues of diabetic mice

ZHAO Yongmei,JI Zhijuan,ZHAO Zhiwei,et al.

Beijing Research Laboratory for Brain Aging,Beijing Xuan Wu Hospital,Beijing,100053

【Abstract】ObjectiveTo study whether Tau protein is hyperphosphorylated in brain tissues of diabetic mice and to study the effect of APP 17 peptide.MethodsMouse diabetic model was produced with streptozotocin, and APP 17 peptide as a protective was injected subcutaneously into diabetic mice. Four weeks later fixative was injected intravascularly into the mice, brain was removed and cryostat sections prepared. Immunohistochemical staining was done with AT-8, Tau-1, PP-2B antibodies, and again with Tau-1 antibody after dephosphorylation.Results In the brains of diabetic mice positive AT-8 reacting neurons were numerous, the cytoplasm was darkly stained, and 2-3 level dendritic processes were visible, while in normal mice and in APP 17 peptide-protected diabetic mice positive cells were scarce and were poorly stained. PP-2B enzyme was markedly diminished in the brains of diabetic mice in comparison to the controls. After APP 17 peptide protection positive staining of PP-2B approximated that in the controls.ConclusionTau protein is hyperphosphorylated at Ser 202/Thr 205 sites in the brains of diabetic mice, which may be, chiefly due to reduction in PP-2B content. The use of APP 17 peptide can normalize the expression of PP-2B and protect Tau protein from hyperphosphorylation.

【Key words】Diabetic encephalopathyTau proteinHyperphosphorylationMice

(Chin J Endocrinol Metab, 1999,15:38-40)

糖尿病和痴呆在老年人群中发病率较高，糖尿病病人常有认知功能障碍，但与痴呆之间的关系并不清楚，Ott等研究了55～99岁的老年人6330例，发现糖尿病724例(11.4%)，265例痴呆病人中59例患有糖尿病(22.3%)，经过多元回归分析，校正年龄和性别，表明糖尿病和痴呆之间存在正相关^〔1〕。Leibson等报道了1455例成年发病的糖尿病病人中981人经一年观察后，101人产生了痴呆，其中77例为老年性痴呆(AD)，经统计学处理表明这些糖尿病人对痴呆的危险性明显增加，相对危险度(RR)=1.66 95%可信区间(CI)为1.34～2.05^〔2〕。Sinclair等的研究也表明糖尿病人出现痴呆明显增加(P＜0.01)^〔3〕，并出现较为严重的认知功能损害和较高程度的生活依赖(P＜0.01)。这些研究表明糖尿病和痴呆密切相关，但是这些关系的分子学基础尚未见报道。

老年痴呆在病理上以脑神经元大量出现神经元纤维缠结(NFT)和老年斑(SP)为特征，神经元内每分子正常Tau蛋白含2分子磷酸，能与微管蛋白结合形成微管，而微管是神经元存活所必需的结构。在AD脑中，Tau蛋白被过多磷酸化，形成成对螺旋细丝(Paired Helical Filaments, PHF)，继之糖化，最终形成NFT。因此，Tau蛋白过多磷酸化是AD最早出现的分子水平上的异常。但是Tau磷酸化的程度取决于使蛋白质磷酸化的激酶和使蛋白质脱磷酸化的磷酸酯酶之间的平衡^〔4〕。我们为探讨糖尿病与AD之间的关系，研究了糖尿病小鼠脑神经元Tau蛋白的磷酸化及其相关的酶PP-2B，以便为研究糖尿病是AD的危险因素提供分子学基础。SP是β淀粉样肽(β-Amyloid, Aβ)沉积而逐渐形成的，Aβ是其前体蛋白(Amyloid Precusor Protein, APP)翻译后加工的产物。然而APP的319-335肽段(APP17肽)具有促进神经元轴突生长和突触形成的作用^〔5〕。基于上述生物活性，我们合成了APP17肽并应用于糖尿病小鼠，观察它对Tau蛋白过度磷酸化的影响，以开拓它防治糖尿病脑病和AD的可能性。

材料和方法

一、实验动物及动物模型复制

昆明小鼠，雄性，体重32～37克，购自医科院药研所，随机分为三组：正常对照组(C组)、糖尿病对照组(DM组)、APP17肽防治组(APP17P+DM组)。APP17肽由本室用固相法合成，HPLC纯化。APP17P+DM组于糖尿病造模前两周起至STZ给药后4周皮下注射APP17肽，每次0.34μg/只，每天一次。STZ购自Sigma公司，用0.1mol/L,pH4.4的柠檬酸缓冲液将STZ配制为20g/L，用前新鲜配制，小鼠禁食12小时后按200mg/kg体重剂量腹腔注射，三天后用血糖仪测尾部非禁食血糖，大于15mmol/L者认为糖尿病模型复制成功。成模后DM组14只，C组小鼠15只，APP17P+DM组15只。

二、免疫组化染色

给STZ 4周后，小鼠用水合氯醛按4ml/kg体重剂量腹腔注射，待麻醉后开胸暴露心脏，经左心室插管快速灌注生理盐水，同时剪开右心耳，待肝脏变白后，改灌4%的多聚甲醛固定液，动物僵直为满意，取脑投入30%的蔗糖多聚甲醛溶液后固定。待脑下沉后，行冰冻切片，厚度为40μm，进行AT-8、Tau-1、蛋白磷酸酶(Protein Phosphatase-2B，PP-2B)及用PP-2B脱磷酸后的Tau-1免疫组化染色^〔6〕。AT-8抗体购自Innogenetics公司，Tau-1抗体和PP-2B抗体为美国K. Iqbal教授赠送。Sp免疫组化试剂盒购自Zymed Laboratories公司，批号为70436475。按说明书进行实验，阴性对照不加一抗，以正常血清代替。

免疫组化定量分析：(1)每组动物各3只，每只于相应海马部位连续切片，每隔2张取1张，即共取15张切片，在10倍物镜下，计算三组相应海马区域内阳性神经元数目。(2)用奔腾Visilog 5图像分析软件对进行免疫组化标记的每张切片随机选5～6个阳性细胞，测其胞浆平均灰度，以反映染色强度。

数据资料处理：计数资料用均数±标准差表示，显著性检验用方差分析法。

结果

AT-8免疫组化染色结果显示在DM组的海马区内有深染的AT-8阳性细胞，高倍镜下可见其胞核淡染，胞浆和突起深染。标记细胞初级树突多，可见到2～3级分支。阳性细胞多为圆形或椭圆形神经元，少数为梭形神经元。深染处胞浆内有颗粒，但不均匀；C组小鼠海马内AT-8阳性细胞数目比DM组明显少，染色淡，标记细胞突起少，未见到明显分支；APP17P+DM组AT-8染色结果与C组相似(图1)。

图1小鼠海马CA1区AT-8免疫组化染色结果(×400)

Fig 1AT-8 immunohistochemical staining of mouse hippocampus CA1 area (×400)

C组阳性细胞少，染色淡；DM组阳性细胞多，胞浆深染，可见2-3级树突分支；APP17P+DM组染色结果与C组相似C group: few positively stained cells, pale-staining; DM group: abundant positively stained cells, darking staining of cytoplasm, 2-3 level dendritic branches visible; APP17P+DM group: results same as C group

C组小鼠及APP17P+DM小鼠用Tau-1单抗染色后在海马区可见阳性反应神经元，高倍镜下其胞核淡染，胞浆和突起深染；DM组小鼠海马区内阳性反应神经元数目明显少于C组，且染色淡。将DM组脑组织切片用PP-2B脱磷酸后再用Tau-1单抗染色结果与C组接近。

用PP-2B抗体染色后C组小鼠海马区内可见PP-2B阳性反应神经元，胞体和突起染色清晰，标记细胞多为中、小型神经元，突起多，可见到4～5级分支，阳性细胞数目多；DM组小鼠海马区内PP-2B阳性反应神经元明显减少，标记细胞突起没有明显着色，在部分切片中见不到明显的PP-2B阳性细胞。APP17P+DM组PP-2B阳性反应神经元的数目和染色程度与C组近似。

三组小鼠不同抗体免疫组化染色阳性神经元数目比较见表1，平均灰度比较见表2。

表1三组小鼠不同抗体免疫组化染色阳性细胞数目比较

Tab 1Comparison of number of positive cells in 3 groups<