关键词： 氨基胍；糖尿病；肾组织；糖化终产物受体；信使RNA

【摘要】目的研究氨基胍对糖尿病肾组织内糖化终产物(AGEs)受体(RAGE)mRNA表达的影响。方法采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测病程8周肾内RAGE mRNA水平。结果诱发糖尿病4周后糖尿病大鼠肾皮、髓质内RAGE mRNA表达增加(P＜0.05)，8周时更为明显(P＜0.05)；口服补充氨基胍4周对肾内这种改变未产生影响(P＞0.05)，给药8周，糖尿病大鼠肾皮、髓质内增强的RAGE mRNA表达明显缓解(P＜0.05)。与此同时，氨基胍在不影响血糖的基础上，使糖尿病大鼠升高的糖化血红蛋白(GHb)水平下降26.72%。结论糖尿病状态下，肾组织内RAGE mRNA高表达可能是高血糖诱发AGEs形成的结果；氨基胍可通过调节RAGE mRNA的异常表达，缓解AGEs对肾组织的损伤。

Effect of aminoguanidine on mRNA expression of specific receptor of the advanced glycation end products in diabetic kidney tissue in rats

HUANG Yufeng,LIN Shanyan,CHENG Meifen,et al

.Department of Nephrology,Huashan Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai,200040

【Abstract】ObjectiveInvestigating the effect of aminoguanidine (AG) on RAGE (receptor for advanced glycation end products) mRNA expression in renal tissue of streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats.MethodsFour groups of rats, including (1)control rats without AG； (2)control rats with AG； (3)diabetic rats without AG and (4)diabetic rats receiving AG, were observed for 8 weeks, with the measurements of RAGE mRNA expression every 4 weeks by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).Results After 4 weeks of diabetes inducement,RAGE mRNA levels showed a continuous increase until 8th week, in both diabetic renal cortex and medulla (P＜0.05, diabetes vs control). The RAGE mRNA levels in renal cortex and medulla of control rats did not change significantly with age. AG, as the prototype inhibitor of AGEs formation, when administered to diabetic rats for 4 weeks, did not have any visible effect on the alterations of renal RAGE mRNA in diabetes. By continuous administration up to 8th week, those alterations of RAGE mRNA both in diabetic renal cortex and medulla were all attenuated (P＜0.05, diabetes with AG vs diabetes without AG). Similarly, after 8 weeks, diabetic rats had a significantly higher GHb level (diabetes vs control: 7.71%±0.22% vs 2.95%±0.52%, P＜0.001). AG treatment for 8 weeks lowered GHb levels by 26.72% (P＜0.05).ConclusionThe excessive gene expression of RAGE in renal tissue of diabetic rats might occur as a result of hyperglycemia-induced AGEs formation and the decrease of AGEs level by AG therapy attenuated the abnormal RAGE gene expression pattern which could contribute to preventing renal damage from AGEs accumulation.

【Key words】AminoguanidineDiabetes mellitusRenal tissueRAGEmRNA

(Chin J Endocrinol Metab, 1999,15:27-30)

葡萄糖通过非酶促糖化的方式与蛋白质或氨基酸的氨基结合，先形成醛胺类产物，即Amadori产物，进而形成中、晚期糖化产物(AGEs)^〔1〕。研究表明，AGEs蓄积与糖尿病肾病的发生和发展密切相关。氨基胍，作为AGEs形成的抑制剂，在动物模型中对糖尿病相关的多脏器损伤(包括糖尿病肾病)有效的干预作用，使得AGEs蓄积在糖尿病肾病发病中的意义更为人们所重视^〔2〕。现已发现，AGEs与细胞表面特异性受体(Receptor for AGEs, RAGE)的相互作用是其致病的关键途径^〔3〕，氨基胍对此有否影响，报道甚少。因此，本文以链脲佐菌素诱发的糖尿病大鼠为模型，对应用氨基胍后肾组织内RAGE mRNA表达的改变进行研究。

材料和方法

一、动物模型的建立与分组

雄性SD大鼠，2月龄，体重180～220g，由上海医科大学放射医学研究所动物中心提供，随机分为正常对照组(C1，11只)，正常对照加氨基胍治疗组(C2，11只)，糖尿病对照组(D，11只)及糖尿病给予氨基胍治疗组(DT，11只)。糖尿病大鼠按65mg/kg体重腹腔注射链脲佐菌素(STZ，购自Sigma公司，溶解于0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液中pH4.5)，依据注射后48小时尿糖为()～()，尾静脉采血测血糖(One Touch II血糖仪)，血糖≥16.7mmol/L者，确定模型建立并纳入本实验。自注射后第3天起D组与DT组均用长效胰岛素2U隔日皮下注射。

二、给药方法

氨基胍治疗组大鼠饮含氨基胍的自来水(1g氨基胍溶解于1L饮水中^〔4〕，相当于50mg*kg^-1*d^-1，盐酸氨基胍购自Sigma公司)，连续给药8周，实验第4周末和第8周末，分两批处死大鼠取材。

三、检测指标及方法

每4周用大鼠代谢笼收集所有大鼠的24小时尿标本，计量后-80℃保存，作尿蛋白和尿肌酐(Cr)测定(尿蛋白测定用comassie亮蓝法，尿肌酐测定用碱性苦味酸法)。四组大鼠分别于病程的第4、8周末，腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后，由股静脉抽血4～6ml，分别留取1ml经EDTA抗凝，测定糖化血红蛋白(GHb)(微柱法，GHb测定微柱购自宁波市慈城生化试剂厂)，4ml非抗凝血经离心管吸取血清，测定血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、葡萄糖(Glu)(用自动生化分析仪测定)，参照有关公式计算内生肌酐清除率(Ccr)。采血后立即游离肾脏，微分离皮、髓质进行RT-PCR分析。

总RNA提取采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步抽提法^〔5〕，用紫外分光光度计(DU-7型，Beckman公司)以及电泳分析确定RNA的量和纯度。所用RNA的A₂₆₀/A₂₈₀在1.8～2.0之间，经电泳每组均可见18S和28S两条较深的电泳条带。

取5μg总RNA，采用逆转录试剂盒(Promega公司)，以Oligo (dT)₁₅为引物合成cDNA，反应总体积为10μl。RAGE和GAPDH的PCR引物分别依据1996年文献^〔6〕报道的序列应用DNA合成仪合成，其序列分别为RAGE：引物1(反义链)，5’CACGCTTCGGTCAGAGCTCA3’，引物2(正义链)，5’ATGAGCAGAGCGGCTATTCC3’，该对引物扩增的cDNA产物长513bp；GAPDH：引物1，5’AGATCCACAACGGATACATT3’，引物2，5’TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3’，该对引物扩增的cDNA产物长309bp。

由华美生物制品工程公司上海分公司提供PCR所需的酶及缓冲液系统，取每份标本的逆转录产物1μl、2μl分别进行GAPDH和RAGE的cDNA PCR扩增，RAGE的扩增条件参照文献^〔5〕，肾皮质的RAGE扩增36轮，髓质的RAGE扩增32轮，GAPDH的扩增条件参照Terada等^〔6〕文献，PCR扩增28轮，本实验室经不同循环数PCR产物的图像分析，验证了上述循环参数基本使PCR扩增控制在指数期内。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后摄照，然后进行光密度扫描，并以GAPDH校正作相对量分析，数值以两者之积分吸光度的比值表示(T90图像分析系统，上海医科大学神经生物学教研室)。

四、统计学方法

数据均以均数±标准差表示，组间比较用方差分析，P＜0.05为有统计学意义。

结果

一、血糖和一般情况

每日补充氨基胍持续8周，正常大鼠体重不受影响，糖尿病大鼠的体重下降有所改善，但仍低于正常对照组；所有大鼠的血糖水平没有明显变化，正常大鼠的GHb水平也不因用药而有所改变，但用药的糖尿病大鼠的GHb水平下降26.72%(表1)。

观察8周的糖尿病大鼠Cr，24小时尿白蛋白排泄量均明显高于正常对照组。经氨基胍治疗后糖尿病大鼠的Cr水平轻度下降，24小时尿白蛋白排泄量明显减少，虽未达到正常水平(表1)，但较第4周时排泄量为低，而用药4周的糖尿病大鼠，尿白蛋白排泄量与未用药的糖尿病组相比，未见改善。

二、肾脏皮、髓质内RAGE的mRNA水平分析

糖尿病诱发4周后，肾皮、髓质内RAGE的mRNA表达明显地高于正常对照(与对照组的积分光密度的比值相比：0.910±0.203对0.157±0.072,P＜0.05，肾皮质；0.659±0.039对0.356±0.090,P＜0.05，肾髓质)，病程8周后，表达持续增加且更为显著(其相对积分光密度值分别为：1.249±0.165,1.044±0.083)。给药4周，

表18周时4组大鼠的各项实验指标的比较(±s)

Tab 1Laboratory data in four groups of rats at 8th week after the onset of diabetes (±s)