胰岛素的信号在靶细胞的传递过程还没有完全阐明，Ca^可能是参与信号传递的介导物质之一^〔1〕。随着钙拮抗剂在临床上广泛而长期的应用，它对糖代谢的影响也日益受到重视。本文应用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)，观察了硝苯地平(NF)对大鼠比目鱼肌细胞胰岛素和葡萄糖刺激的Ca^内流的作用。

一、试剂

1.KHBS液、无糖无钙Hanks液pH值7.4。

2.硝苯地平(NF)液：用二甲基亚砜(DMSO)将NF纯品配成10mmol/L原液，用前以KHBS稀释至0.5μmol/L、1.0 μmol/L、10μmol/L二甲基亚砜在KHBS中浓度为0.005～0.1%。

3.工作液：葡萄糖溶于KHBS液中，配制成含葡萄糖16.7mmol/L的KHBS-G液，pH 7.4。纯化结晶猪胰岛素以少量0.01mol/L盐酸溶解，再用KHBS-G液配制成含胰岛素100μu/ml溶液。

4.荧光染料：Fluo-3AM用DMSO配制成1mmol/L原液，-20℃冻存备用。F 127用DMSO配制成20%溶液(W/V)。

二、细胞培养方法

分离Wistar大鼠比目鱼肌，剪碎并用0.05%的II型胶原酶消化，分离出的细胞制成悬液，接种于培养瓶中，培养3天，用0.25%胰蛋白酶消化，重新接种于96孔板，每孔细胞数为1×10⁴。培养24小时即见细胞贴壁，隔天换液，3天后用于细胞Ca^观察。

三、实验分组

NF在基础状态下对细胞Ca^的影响：按加入NF浓度0、0.5、1.0和10.0 μmol/L分为4组。

四、检测方法

1.大鼠骨胳肌细胞Ca^变化的检测：细胞加入荧光染料，于37℃、5% CO₂条件下孵育60分钟，将Fluo-3AM负载的细胞置于LSCM下，在普通光镜下选择适当视野，以488nm长波的氩离子激光扫描，得到肌细胞的荧光图像，圈定预定观察的细胞，以3～6秒的速度间隔连续扫描，总时间1～4分钟，根据需要，扫描前及扫描过程中加入不同的作用物。

2.图像处理：扫描所得一系列荧光图象由计算机收集并贮存。所得图象由附带的INSIGHT-IQ分析软件进行处理，可得到细胞内Ca^变化的时间效应(相对荧光强度值)曲线。实验所用细胞接种密度及培养时间一致。实验时设定相同的激光扫描强度、增益等参数，以保持不同批次实验的稳定性，每组实验重复2次。

五、结果

1.NF在基础状态下对肌细胞Ca⁺⁺的影响：不同浓度NF对基础状态下葡萄糖诱导的Ca⁺⁺升高没有明显影响。

2.NF在胰岛素刺激下对肌细胞Ca⁺⁺的影响：在工作液作用下细胞内Ca⁺⁺在几秒钟内迅速升高，随着NF浓度的升高，细胞Ca⁺⁺下降逐渐显著，表明NF对胰岛素刺激的肌细胞Ca⁺⁺升高有显著的抑制作用，存在效应与剂量相关性。

六、讨论

LSCM由激光显微镜、探测系统和图象分析系统组成。该技术在成象原理上进行了改进，采用独特的共聚焦光学系统，使照明点和探测点共轭，从而可以有效抑制同一焦平面上非测量点的杂散荧光，且避免焦平面上下衍射光所至的图象模糊和虚相的干扰，使分辨率明显提高。Fluo-3AM是一种单波长可见激光发射的Ca^敏感的荧光探针，它避免了Fluo-2等Ca^探针测量Ca^时复杂的紫外光激发的缺点，也避免了紫外光对细胞可能的损伤。Fluo-3AM以Fluo-3乙酰甲酯的形式通过细胞膜进入细胞浆内，在细胞内非特异性脂酶的作用下水解掉AM基，成为游离形式的Fluo-3，其本身只有很弱的荧光，但可以敏感地与游离Ca^结合，在488nm波长的氩离子激光激发下激发出很强的荧光^〔2〕，其荧光强度随与Ca^结合的数量及Ca^的浓度而改变。利用Fluo-3AM的这些特性，可以灵敏地检测细胞内Ca^浓度的变化。

目前对胰岛素影响细胞膜钙泵活动的机制尚没有完全了解。Westfall^〔3〕等证明NF和维拉帕米可抑制胰岛素介导的骨胳肌葡萄糖转运，提示Ca^通道可调节胰岛素刺激的葡萄糖转运。在脂肪细胞，30μmol/L维拉帕米和25μmol/L NF均能抑制胰岛素介导的葡萄糖摄取。我们的实验结果显示，0.5、1.0和10.0 μmol/L三种不同浓度的硝苯地平均能抑制胰岛素刺激的大鼠比目鱼肌细胞内Ca^升高，抑制程度与NF浓度呈正相关。在基础状态下，低浓度NF(0.5～1.0 μmol/L)对细胞内Ca^升高没有影响，高浓度NF(10.0μmol/L)对细胞内Ca^升高有抑制作用，但较弱。而胰岛素介导的细胞内Ca^升高能被低浓度NF所抑制，提示NF对胰岛素介导的细胞内Ca^流动或钙通道功能活跃时作用更强、更敏感。胰岛素作用于靶细胞时，细胞内Ca^浓度增高，提示Ca^可能具有介导胰岛素在靶细胞生物学效应的作用。NF抑制胰岛素刺激的细胞内Ca^聚集，说明NF可能会阻断胰岛素的生物学效应，结果使糖代谢的平衡遭到破坏，使血糖升高。也可能由于离体细胞对NF较敏感，因而还有待于进一步研究探讨。

参考文献

[1]曾淑范. 胰岛素分子生物学与糖尿病. 上篇. 天津科技翻译出版公司. 1996：9.

[2]Wada MH. Detecting calcium response in cultured cells using the visible wave lenth Ca^ probe, Fluo-3. Meridran Instruments Application, 1989;Note E-2.

[3]Westfall MV, Sayeed MM. Effect of Ca^channel agonists and antagonists on skeletal muscle sugar transport. Am J Physiol, 1990,258:R462-R468.

(收稿：1997-10-03修回：1998-04-23)