关键词： 抗磷酸酪氨酸抗体；红细胞；胰岛素受体；自身磷酸化；酶联免疫吸附测定

【摘要】目的建立人红细胞胰岛素受体自身磷酸化测定法。方法应用合成的磷酸酪氨酸-钥孔帽贝血蓝蛋白(PY-KLH)免疫家兔得到抗血清，将纯化的抗磷酸酪氨酸抗体作为第一抗体，羊抗兔Ig酶结合物(辣根过氧化物酶标记)作为第二抗体，建立双抗体夹心酶联免疫吸附测定法。结果批内变异系数为8.4%，批间变异系数为9.0%。20例健康人的红细胞IR的自身磷酸化活性，测定值为0.150±0.022nmol PY/mg受体蛋白。在体外，胰岛素在10^-6mol/L时对自身磷酸化达到最大激活。结论用酶免法测定人红细胞胰岛素受体灵敏、特异、简便，为胰岛素作用机制的理论研究、胰岛素受体基因突变的检测和糖尿病及其它胰岛素抵抗综合症的病因及治疗的探讨提供了有效的方法。

ELISA method for autophosphorylation of insulin receptor from human erythrocytes

Zhu Ning,Wang Jiayi,Tian Enjiang,et al.Department of Biochemistry,Tianjin Medical University,Tianjin,300070

【Abstract】ObjectiveTo establish a method of detecting autophosphorylated insulin receptor from erythrocytes.MethodsPhosphotyrosine was first combined with hemocyanin from keyhole limpets (KLH). Then, rabbits were immuned with the complete antigen and antisera were gained. The ELISA system consisted of purified antiphosphotyrosine antibody as first antibody and sheep antirabbit lgG-HRP as second antibody.ResultsCV within the batch was 8.4%. CV between the batches was 9.0%. The value for autophosphorylation of insulin receptor from erythrocytes in 20 normal individuals was 0.150±0.022nmoL PY/mg receptor protein. In vitro, autophosphorylation of insulin reached maximum activation at 10^-6mol/L insulin.ConclusionThe ELISA method is sensitive, specific and simple for autophosphorylation of insulin receptor. It provides a useful tool for theoretical research of mechanism of insulin action, detection of gene mutation of insulin receptor and exploration of cause and care for insulin resistance.

【Key words】Antiphosphotyrosine antibodyErythrocyteInsulin receptorAutophosphorylationELISA

(Chin J Endocrinol Metab, 1998, 14:373-376)

当胰岛素发挥生理作用时，首先与其受体的α亚基结合，这种结合引起胰岛素受体构象发生改变，促进β亚基的酪氨酸激酶域上多个位点的酪氨酸残基磷酸化，并激活该受体具有的酪氨酸蛋白激酶，活化的受体激酶又可磷酸化多种内源性底物上的酪氨酸残基，然后经多重机制，体现胰岛素的生理功能。研究表明，胰岛素受体的自身磷酸化和酪氨酸蛋白激酶的作用在胰岛素作用过程中是关键性的早期步骤^〔1，2〕。

产生胰岛素抵抗的原因很多，其中胰岛素受体介导的胰岛素信号传递出现障碍是很常见的原因，此障碍可发生在受体或受体后水平，胰岛素受体自身磷酸化以及受体酪氨酸蛋白激酶缺陷均可导致胰岛素抵抗综合症^〔3〕。胰岛素抵抗在几种疾病的发病机理上起重要作用，包括非胰岛素依赖型糖尿病、高脂血症及高血压等。

因此，建立一种灵敏、特异、简便的胰岛素受体自身磷酸化的检测方法以反映受体酪氨酸激酶活性，对于进行胰岛素的作用机制及胰岛素抵抗现象等的研究是不可缺少的。

材料和方法

一、材料

1.试剂：磷酸酪氨酸(PY)、钥孔帽贝血蓝蛋白(KLH)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)(EDAC)、PMSF、Triton X-100、N-乙酰葡糖胺、麦胚凝集素(WGA)、5'-ATP和MnCl₂均系Sigma公司产品，福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂系Gibco公司产品，DEAE-纤维素-32购自Whatman公司，HEPES购自E. Merck公司，单组分结晶猪胰岛素系丹麦NOVO研究所赠送，其余均为国产试剂，最优级。

2.仪器：GL20A全自动高速冷冻离心机，紫外分光光度计UV-120-02，511型酶标分析仪。

二、方法

1.完全抗原的合成：参照Kamps方法^〔4〕改进。在小烧杯中，称0.26mmol磷酸酪氨酸，加入1.2ml H₂O，缓慢滴加少量2.0mol/L NaOH，至磷酸酪氨酸溶解，调整pH至5.7，加H₂O至终体积2.0ml。滴加10mg KLH(溶解在50%甘油中)，将小烧杯置于磁力搅拌器上，室温下搅拌溶液，每隔1小时，加0.17mmol EDAC，共6次，用1.0mol/L HCl保持pH为6.0，继续搅拌过夜，-80℃保存。

2.抗血清的制备：将合成的抗原免疫大耳白兔，每次免疫的抗原用量为1.5mg(1ml)，加入等体积的完全或不完全福氏佐剂乳化，背部多点皮内注射，基础免疫1次，加强免疫4次，每次间隔2周，最后1次免疫10天后取血，测定效价，最后颈动脉放血，分离血清，分装后，置-80℃保存备用。

3.抗血清效价检测：在96孔反应板每孔加入50μg/ml磷酸酪氨酸100μl，4℃过夜，进行包被，洗涤。将兔抗磷酸酪氨酸免疫血清分别稀释为1∶100、1∶500、1∶2500和1∶12500，每孔各加100μl，37℃保温30分钟，洗涤。各加入1∶100稀释的羊抗兔Ig酶结合物100μl，37℃保温30分钟，洗涤。加入TMB 100μl，20分钟后，加2mol/L硫酸终止反应。450nm比色，观察各孔颜色的变化。

4.抗体的纯化：参照朱平方法^〔5〕，并作改进。(1)盐析：将兔血清放入小烧杯，边搅拌边缓慢滴加饱和硫酸铵至33%饱和度，用浓氨水调pH至7.0，4℃静置6小时，3000g离心30分钟，弃去沉淀。将上清置于另一小烧杯中，边搅拌边缓慢滴加饱和硫酸铵至50%饱和度，浓氨水调pH至7.0，4℃静置过夜，3000g离心30分钟，弃上清。加入0.8 ml 10mmol/L Tris缓冲液(pH 8.5)，溶解沉淀。将抗体溶液装入透析袋中，对10mmol/L Tris缓冲液(pH 8.5)透析过夜。(2)离子交换柱层析：将DEAE-纤维素-32预处理后，装柱，用10mmol/L Tris缓冲液(pH 8.5)平衡，上样，然后用50mmol/L NaCl, 10mmol/L Tris缓冲液(pH 8.5)洗去杂蛋白，再用100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris缓冲液(pH 8.5)洗脱，收集洗脱峰蛋白。

5.人红细胞胰岛素受体的提取和纯化：(1)提取：抽取人血10ml，肝素抗凝，1000g离心10分钟，弃去血浆。血细胞中加入等体积生理盐水混合，再加在同样体积的淋巴细胞分离液上，1000g离心20分钟，红细胞中加入10倍体积的0.02mmol/L EDTA，2mmol/L Tris缓冲液(pH 7.4)，低渗溶胀30分钟，16000g离心30分钟，弃去上清，等渗溶液洗膜三次。红细胞膜中加入1ml 1% Triton X-100(v/v),2mmol/L PMSF,50mmol/L HEPES缓冲液(pH 7.4)，在磁力搅拌器上搅拌1小时之后，200000g离心60分钟，弃去沉淀。(2)纯化：WGA-Agarose装柱，上样后，先用0.15mmol/L NaCl,0.05% Triton X-100,50mmol/L HEPES缓冲液(pH 7.4)洗下杂质，再用0.3mol/L N-乙酰葡糖胺，0.15mmol/L NaCl,0.05% Triton X-100,50mmol/L HEPES缓冲液(pH 7.4)洗脱。收集洗脱峰蛋白，以改良Lowry法测定蛋白含量，-80℃保存。

整个提取、纯化过程均在4℃进行。

6.胰岛素受体的自身磷酸化反应：用50mmol/L HEPES缓冲液(pH 7.4)稀释纯化的胰岛素受体285μg，与10^-7mol/L胰岛素4℃预保温16小时，加入MnCl₂(终浓度4mmol/L)和ATP(终浓度50μmol/L)，启动磷酸化反应，总体积1ml，24℃保温5分钟，然后加入1ml预冷的终止液(50mmol/L NaF,5mmol/L焦磷酸钠，5mmol/L EDTA)终止反应。空白管除不加胰岛素外，其余相同。

7.磷酸化的胰岛素受体的ELISA测定：用10mmol/L Tris缓冲液(pH 8.5)将纯化的抗磷酸酪氨酸抗体稀释为50μg/ml，在96孔反应板每孔各加入100μl，4℃过夜，进行包被，洗涤。然后加入待测的经过自身磷酸化的胰岛素受体100μl，37℃温育2小时，洗涤。再加入纯化的抗磷酸酪氨酸抗体100μl，37℃温育2小时，洗涤。之后再加入1∶100稀释的羊抗兔Ig酶结合物100μl，37℃保温2小时，洗涤。加TMB 100μl，室温20分钟，最后加50μl 2mol/L硫酸终止反应。测定OD值(450nm)。

结果

一、PY-KLH偶联物的偶联率

依下式^〔6〕估算每个KLH分子中偶联的磷酸酪氨酸分子的数目。

〔H〕=〔A^C₂₆₈-〔A^C₂₉₀(A^K₂₆₈/A^K₂₉₀)〕/ε^h₂₆₈ε^h₂₆₈∶783

〔C〕=A^C₂₉₀(A^K₂₈₀/A^K₂₉₀)〕/ε^K₂₈₀ε^K₂₈₀∶1.77

PY数/KLH=〔H〕×10⁵/〔C〕

A^K₂₆₈、A^K₂₈₀和A^K