关键词： 醛糖还原酶；转染；糖尿病并发症

【摘要】目的建立一内含人醛糖还原酶(hAR)cDNA的细胞株，并研究其在高葡萄糖环境中的基因表达及生化特性。方法将全长hAR cDNA基因插入质粒载体pcDNAneo中，并将AR正义、反义构建以及pcDNAneo载体本身分别转染至中华仓鼠卵巢(CHO)细胞中。用放免法测定这些细胞株在高糖环境中的山梨醇水平。用Northern杂交检测其mRNA表达，并用分光光度法检测AR活性。结果有四株AR正义构建的细胞株显示了高山梨醇水平。随机将其中一株细胞作进一步分析，发现该细胞株具有AR mRNA表达，并且在高糖环境中AR活性亦显著升高。以上升高的山梨醇及酶活性均被AR抑制剂-HOE 843所抑制。结论本研究结果表明已成功地建立了一细胞系统，它为进一步研究AR在糖尿病并发症发病机理中的作用提供了手段。

The establishment of CHO cell line transfected with aldose reductase cDNA, its gene expression and biochemical characters

Yan Haidong,Jeffery D Zajac,Marjorie E Dunlop,et al.Department of Medicine,The First Affiliated Hospital,China Medical University,Shenyang,110001

【Abstract】ObjectiveTo create a cell line containing human aldose reductase (hAR) cDNA and to investigate its gene expression and biochemical characters under high glucose concentrations.MethodsThe full hAR cDNA was insert into the expression vector-pcDNAneo. Cells from Chinese hamster ovary (CHO) were transfected with the AR sense construct, AR antisense construct and pcDNAneo vector alone. Sorbitol level was determined by RIA. AR mRNA expression was measured by Northern blots and AR activity was determined by using spectrophotometrical method.ResultsFour sense construct clones showed an elevated sorbitol production and one cell line was randomly chosen for further study. Northern analysis showed this cell line expressed hAR mRNA. Furthermore, this cell line had higher AR enzyme activity in response to raised glucose concentration. Increased sorbitol level and AR activity were significantly inhibited by an AR inhibitor-HOE843.ConclusionWe have established a cell line which would be an appropriate model to study the effect of AR on the pathogenesis of diabetic complication.

【Key words】Aldose reductaseTransfectionDiabetic complication

(Chin J Endocrinol Metab, 1998, 14:380～382)

高血糖是糖尿病并发症的形成因素。高血糖能通过多种途径导致糖尿病并发症的早期功能性改变继而晚期结构的改变。醛糖还原酶(AR)异常就是导致其发病的途径之一。为了进一步明确过度增强的AR能否参与糖尿病并发症的发病，我们将AR cDNA基因转染到中华仓鼠(CHO)细胞中以建立一模式细胞系统，用于在高糖环境中AR基因的表达及其生化特性。

材料和方法

一、材料

hAR cDNA由香港大学分子生物学研究所的S Chung博士提供。pcDNAneo购自Invitrogen公司。(γ-³²P)ATP购自澳大利亚Bresates公司，G-418从Gibco BRL公司购买。HOE843由Hoechst AK engehschaft(德国)提供，其余化学试剂均从美国Sigma公司购置。

二、方法

1.DNA载体构建：全长hAR cDNA自质粒载体Bluescript中的EcoR I位点^〔1〕中摘出后插入到质粒载体pcDNAneo中，该载体含有巨细胞病毒(CMV)调节区及可选择性标记neo。反义hAR cDNA同时也被插入到该载体中作为对照。限制性酶消化及Southern杂交分析均已证实这些重组的DNA构建是符合设计要求的。

2.稳定性细胞转染及培养：用高压电穿孔法^〔2〕将AR正义、反义构建以及pcDNAneo载体自身转染到约1×10⁷的CHO细胞中去。首先CHO细胞被悬浮在4℃转染缓冲液中，随之经450伏/960微法拉的电击后，将细胞置于含新霉素G418的α-MEM培养液中进行选择性培养。三周后抗G418的细胞克隆被分离，然后以观察这些克隆的山梨醇产物的增加与否来进行筛选。经筛选后的细胞继续培养于相同培养液中并按设定加入不同浓度的葡萄糖。AR抑制剂(ARI)-HOE843则在细胞培养的最后48小时加入培养液中。

3.AR mRNA的分析：用硫氰酸胍方法^〔3〕将总RNA从转染的CHO细胞中提取并纯化。该RNA首先电泳于1.4%琼脂甲醛凝胶，然后转移到Zeta-Probe纤维膜上。全长hAR cDNA(1.4kb)被用作探针，在核苷酸激酶的作用下以γ-³²P作末端标记。杂交后mRNA用放射自显影进行分析。

4.山梨醇水平测定：当转染的CHO细胞培养在25mmol/L葡萄糖的α-MEM中，约85%融合时洗涤细胞并刮落，随即置于300μl的2.5%高氯酸溶液中。离心后取其上清液并用NaOH将其中和至pH 7.0，用同位素放射方法进行山梨醇水平测定^〔4〕。

5.AR活性测定：转染的CHO细胞分别培养于含5.6、25、50mmol/L葡萄糖的α-MEM培养液中。5天后在85%融合时收集细胞并匀浆化。匀浆液经离心取其上清液，在标本中加入反应液(0.2mol/L半乳糖，0.4mol/L(NH₄)₂SO₄，0.2mmol/L NADPH,10mmol/L NaH₂PO₄,pH 6.5)，其中半乳糖为反应底物。用分光光度计在340nm波长下，以NADPH吸收率的减少来计算AR的酶活性^〔5〕。

6.统计学分析：实验结果以x±s表示。用非配对t检验进行统计学计算，以P＜0.05作为显著性差异的指标(文中另有所示者除外)。

结果

一、hAR cDNA转染CHO细胞的产生及最初细胞克隆的筛选

转染的细胞经G418的选择，有17个AR正义构建、13个AR反义构建及10个载体的细胞克隆用测定山梨醇水平进行筛选。结果有四个AR正义克隆在高葡萄糖环境中显示了增高的山梨醇水平。我们随机地将其中一个细胞株选作进一步研究并命名为CHAR8(附图)。由于山梨醇水平在载体与AR反义构建转染细胞株之间无明显的差别，以后实验即仅用载体转染的细胞株作为对照组。

附图AR转染的CHO细胞的山梨醇水平，其值示为pmol/标本。8为CHAR8细胞株

FigureSorbitol production in AR transfected CHO cells. Values are expressed as pmol/sample. 8 indicates CHAR8 cell line

二、AR基因在转染CHO细胞中的mRNA表达

Northern杂交中，在对照组及CHAR8细胞均可见一低位的条带(1.4kb)。这个条带代表了转染CHO细胞的内源性AR分子。而另一约2.6 kb的高位条带仅在CHAR8细胞中出现，它代表了转染的hAR mRNA表达。该条带之所以大于预计的AR mRNA大小，是因为它不仅含有转染的hAR mRNA，而且还附有一部分读越过的载体缝接(splice)部位及poly A部位。为了证明这点，我们用一段从pcDNAneo中切下的片段(缝接部位—它特殊地针对DNA读越过的区域)作为探针，做另一Northern杂交。出现一杂交的条带，其大小完全与Northern中的2.6kb一致。因此证实在CHAR8细胞中的2.6kb的条带确实含有读越过pcDNAneo下游缝接区及poly A区域。

为了使Northern杂交的结果标准化，同一滤膜经洗涤后再度与pSV2neo质粒DNA探针杂交。结果与5.6mmol/L葡萄糖的培养液相比，AR mRNA在25mmol/L及50mmol/L葡萄糖培养液中无明显的增加。

三、转染CHO细胞的AR的酶活性

CHAR8及对照组细胞分别培养于5.6、25及50mmol/L的葡萄糖溶液后测定AR活性。与对照组相比，CHAR8细胞在25及50mmol/L葡萄糖培养液中，其酶活性显著增加(P＜0.01)。对照组细胞的酶活性虽也随着糖浓度的升高而有所增加，但无显著性差异。

四、ARI对转染CHO细胞的山梨醇水平及醛糖还原酶活性的作用

为了观察ARI是否能影响转染细胞中增高的山梨醇水平及AR活性，将HOE843置入细胞培养液中。结果CHAR8细胞在5.6，25，50mmol/L的葡萄糖培养液中，增高的AR活性均被显著地抑制(15.6±3.8→5.0±0.6mU/mg,30.7±2.7→6.0±0.7mU/mg,42.2±5.7→3.4±0.7mU/mg,P均＜0.05)。在相同的条件下，在5.6mmol/L葡萄糖中，HOE843未影响山梨醇水平，但在高浓度(25mmol/L)葡萄糖中，HOE843明显地抑制了山梨醇水平(296±17→156±15pmol/mg,对照组194±21→138±11pmol/mg,P＜0.05)。

讨论

本研究采用细胞分子生物学的方法研究了增强的AR基因的生化特性。首先我们将全长的hAR cDNA成功地克隆到哺乳动物质粒载体pcDNAneo中。随之将设计的DNA构建稳定地转染到CHO细胞中并以山梨醇浓度测定作为细胞克隆选择的标志。AR mRNA的表达及