关键词： 肥胖基因；瘦素；分子克隆；DNA

【摘要】目的克隆中国人肥胖基因，并进行序列分析和在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR法从中国人脂肪组织RNA中扩增出肥胖基因(Obese gene)，进行核苷酸顺序分析，并将该基因克隆入原核表达载体，在大肠杆菌中表达。结果克隆了中国人肥胖基因，其cDNA顺序与已报道的白种人的序列完全一致，并成功在大肠杆菌中获得表达。结论本项工作为进一步研究肥胖基因在肥胖症和糖尿病等病人中的表达情况及探讨肥胖基因的作用机制打下了基础。

The molecular cloning,sequence analysis and high efficiency expression in E.coli of Chinese obese gene hou Wei,Miao Weimin,Zhou Bingrong,et al.Department of Microbiology,Second Military Medical University,Shanghai,200433

【Abstract】ObjectiveTo probe into the positional cloning of the Chinese obese gene, thereby providing an important approach to research of the mechanisms of obesity.MethodsThe obese gene was amplified from the Chinese adipose tissue RNA by RT-PCR.ResultsSequencing analysis showed that the Chinese obese gene cDNA sequence was identical to that of Caucasian reported previously. The gene was cloned into a prokaryotic expression vector and high efficiency expression was realized in E.coli.ConclusionThis work is the basis for further researches on mechanisms of the obese gene product-leptin and its potential effect on treatment of obesity and diabetes mellitus, etc.

【Key words】Obese geneLeptinMolecular cloningDNA

(Chin J Endocrinol Metab, 1998,14：228-231)

随着人类生活水平的提高，肥胖已成为当今世界的一个常见问题。肥胖症是摄食和能耗平衡机制的失调，可引起多种疾病，如2型糖尿病、高血压、高血脂和癌症等。肥胖的人群每年花费300亿美元试图使自己变得苗条，那些无力减轻体重的人们将成为糖尿病和心血管疾病的高危人群。很早以前人们就开始对肥胖症进行研究，1783年Lavoisier和Laplace研究表明能量平衡受生理调节。1950年发现了第一个隐性基因突变，命名为肥胖基因(Obese gene)^〔1〕，它是一个单基因突变，导致重度肥胖和2型糖尿病^〔2〕，但其研究一直进展甚微。动物试验表明将肥胖鼠和正常鼠血液循环相连，肥胖鼠体重有所下降，提示正常鼠体内有一种因子可控制过度肥胖，而肥胖鼠则因基因突变而使该因子表达减少或作用丧失。经过8年努力，Friedman实验组运用定位克隆(Positional cloning)技术，分离得到小鼠的肥胖基因并得到人的同源序列^〔3〕，为揭开肥胖症之迷及肥胖症的诊治奠定了基础。瘦素作用于下丘脑，控制代谢、能耗和生殖系统，调节体内脂肪含量。实验表明，重组的瘦素具有使肥胖小鼠代谢和体重正常化，恢复肥胖基因缺陷小鼠生育能力等活性，而无明显的副作用^〔4，5〕。进一步研究发现，瘦素的受体基因正是以前报道的糖尿病基因(Diabetic gene)^〔6，7〕，提示肥胖基因和糖尿病的关系密切。为了进一步研究瘦素作用机制及治疗肥胖症和糖尿病的可能性，我们运用RT-PCR的方法，成功完成中国人肥胖基因的克隆，序列分析，并在大肠杆菌中表达。

材料和方法

一、材料

1.脂肪组织：取自男性中国人胃切除手术病人的正常大网膜，液氮冻存备用。

2.试剂：RNA抽提液Trizol购自美国Gibco BRL公司，反转录试剂盒购自美国Promega公司，PCR试剂盒和pUC19测序载体购自上海华美生物工程公司，表达载体系统PROEX^TMHT Prokaryotic Expression System购自美国Gibco BRL公司。其余试剂均为进口或国产，分析纯。

3.仪器：高速组织匀浆机为上海标本模具厂产品，2400型PCR仪为美国PE公司产品，高速冷冻离心机为德国Heraeus产品。

二、方法

1.脂肪组织的制备和RNA抽提

新鲜脂肪组织立即置于液氮冻存。取1克冻存的大网膜脂肪组织，剪成数小块，在总量为10ml的Trizol液中高速匀浆1分钟。将组织匀浆液吸入50ml离心管，于室温下静置5分钟，加入2ml氯仿，剧烈振摇混匀后，室温静置3分钟，然后11 000g 4℃离心15分钟，将上层无色水相吸入一新管，加入5ml异丙醇，室温孵育10分钟，然后11 000g 4℃离心10分钟，75%乙醇洗涤RNA沉淀，7 500g 4℃离心5分钟，稍干燥后用400μl无RNase的双蒸水溶解。

2.反转录PCR

根据已报道的序列^〔3〕设计引物，P1：5’-AAC GAA TTC ATG GTG CCC ATC CAA AAA GTC CAA-3’；P2：5’-TTT GGA TCC TCA GCA CCC AGG GCT GCG GTC-3’。以提取的RNA与P2引物70℃共同孵育5分钟后置冰浴。第一链cDNA合成反应体系为200u AMV反转录酶，5μl 5×缓冲液，1μl RNasin，2μg RNA，四种dNTP(各250μmol/L)。100pmol/L P2引物，总体积25μl,37℃，1小时。取5μl cDNA产物进行PCR扩增，反应体系为5u Taq酶，5μl 10×缓冲液，四种dNTP(各250μmol/L)，P1和P2引物各100pmol/L，总体积50μl,94℃ 5分钟后行PCR扩增，循环条件为94℃变性30秒，60℃复性30秒，72℃延伸1分钟，35循环后72℃延伸10分钟，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

3.肥胖基因的分子克隆及DNA顺序分析

将肥胖基因的RT-PCR产物电泳纯化后行EcoR I和BamH I双酶切，与同样经EcoRI和BamH I双酶切的pUC19连接。连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞，LB培养基培养过夜。以IPTG/X-Gal体系筛选白色菌落，碱法快速抽提质粒，酶切后电泳鉴定重组质粒。用ABI 377荧光自动测序仪进行DNA顺序分析。

图1肥胖基因表达载体构建示意图

Fig 1Scheme of the construction of obese gene expression vector

4.肥胖基因的原核表达

用EcoR I和Sal I将肥胖基因从pUC19载体上切下，克隆入六聚组氨酸融合表达载体pPROEX HTa(图1)。重组质粒转化E.coli DH5α并经酶切电泳鉴定。接种重组质粒的单菌落于3 ml LB中，37℃振摇培养过夜，按1%比例转接至30 ml LB中，37℃振摇培养3小时，使OD₆₀₀约等于0.3～0.4，加入IPTG至终浓度为0.4mol/L，继续培养3小时，离心收集菌体，进行SDS-PAGE电泳。

结果

一、脂肪组织RNA抽提和反转录PCR

运用Trizol试剂得到了非常满意的总RNA，电泳条带显示18s和28s rRNA分别在1.7kb和4.5 kb位置，比例约为1:2，可见总RNA完整性和片段大小均很好。根据已知序列设计引物，以中国人脂肪组织RNA为模板，结果非常特异地扩增出约500bp片段的肥胖基因条带(图2)。

二、肥胖基因的分子克隆及DNA顺序分析

用测序载体pUC19顺利地对肥胖基因PCR产物进行了克隆(图3)。通过ABI 377荧光自动化测序，证明其序列与Friedman实验组报道的白种人完全一致(图4)。

图2用反转录PCR法扩增肥胖基因

Fig 2Obese gene amplified by RT-PCR

1PCR分子量标准PCR molecular weight marker

2RT-PCR扩增产物RT-PCR product

箭头所指为肥胖基因条带Arrow indicates the obese gene band

图3肥胖基因的分子克隆及酶切鉴定

Fig 3Molecular cloning and enzyme digestion of the obese gene

1DNA分子量标准DNA molecular weight marker

2重组的pUC19质粒Recombinant pUC19 plasmid

3重组的pUC19质粒经EcoR I和BamH I酶切Recombinant pUC19 plasmid digested by EcoR I and BamH I 箭头所指为肥胖基因条带Arrow indicates the obese gene band

ATGGT GCCCA TCCAA AAAGT CCAAG ATGAC ACCAA AACCC TCATC AAGAC AATTG TCACC

AGGAT CAATG ACATT TCACA CACGC AGTCA GTCTC CTCCA AACAG AAAGT CACCG GTTTG

GACTT CATTC CTGGG CTCCA CCCCA TCCTG ACCTT ATCCA AGATG GACCA GACAC TGGCA

GTCT