关键词： 人胚胎胰岛；白细胞介素6；重组人γ干扰素

【摘要】目的探讨重组人γ干扰素(rhIFNγ)对人胚胎胰岛分泌白细胞介素6(IL-6)以及对胰岛分泌功能的影响，为IFNγ和IL-6在1型糖尿病中的可能作用提供依据。方法采用胶原酶V型消化方法分离人胚胎胰岛，并对其进行原代培养，加入不同浓度的rhIFNγ培养48小时收获上清，进行IL-6、胰岛素、胰升血糖素活性检测和IL-6单抗中和试验，对rhIFNγ刺激和对照组胰岛RNA进行IL-6 RNA斑点杂交。结果(1)rhIFNγ刺激后胰岛培养上清IL-6含量显著升高，当rhIFNγ浓度在100u/ml时IL-6含量最高；(2)IL-6单抗对rhIFNγ刺激的胰岛培养上清中IL-6有很强的中和效应；(3)斑点杂交结果显示rhIFNγ刺激的胰岛RNA中IL-6 mRNA含量高于对照组；(4)人胚胎胰岛受rhIFNγ刺激后培养上清胰岛素降低不明显；(5)人胚胎胰岛受rhIFNγ刺激后培养上清胰升血糖素分泌能力明显升高，分泌趋势与IL-6相似。结论rhIFNγ可以促进胰岛分泌IL-6，而IL-6的过度分泌可以加重1型糖尿病的进程。

The effects of rhIFNγ on human fetal islet function and IL-6 productionSun Rui,Tian Zhigang,Zhang Jianhua,et al.Shandong Cancer Biotherapy Center,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan,250062

【Abstract】ObjectiveTo study effects of rhIFNγ on fetal islet function and IL-6 prodction in vitro.MethodsThe islets from fetal pancreas were separated by collagenase type V (0.5mg/ml) and cultured in vitro. The islets were exposed for 48 hours to culture medium alone or with different concentrations of rhIFNγ. The supernatants of culture of human fetal islets were assayed for IL-6, insulin and glucagon.ResultsThe results showed: (1)IL-6 activity was increased by 3.24 folds (87-282mU/islet) when islets were exposed to rhIFNγ (100u/ml); (2)IL-6 monoclonal antibody significantly reduced the IL-6 activity in islet supernatants from control group or from islets exposed to rhIFNγ; (3)IL-6 mRNA in human fetal islets exposed to rhIFNγ was higher than that in control in dot hybridization; (4)Soluble insulin released to supernatants was slightly decreased (0.71-0.57 IU/islet) and cellular insulin within islets slightly increased (0.75-0.85 IU/islet); (5)Glucagon secretion was significantly increased by 3.2 folds (1.02-3.3pg/islet).ConclusionIL-6 production by pancreatic islets is up-regulated by rhIFNγ, and IL-6 may act as a costimulator for autoreactive B and T lymphocytes in autoimmune diabetes.

【Key words】Human fetal isletIL-6rhIFNγ

(Chin J Endocrinol Metab, 1998,14：236-239)

研究表明，白细胞介素6(IL-6)和γ干扰素(IFNγ)参与1型糖尿病的自身免疫发病过程，非肥胖型糖尿病(NOD)鼠在接受同基因胰岛移植后发生单核淋巴细胞浸润，胰岛β细胞被选择性破坏，其中有大量IFN阳性细胞，可导致1型糖尿病的发生^〔1〕；IFNγ可以促进小鼠胰岛分泌IL-6，而IL-6又可促进胰岛分泌胰岛素^〔2〕。提示二者在胰岛功能的调节中可扮演不同角色，也预示着二者在1型糖尿病发病中可起不同的作用。为了进一步探讨正常人胰岛在IFNγ作用下对IL-6的分泌以及胰岛功能的影响，为IFNγ和IL-6在1型糖尿病中的可能作用提供依据，我们选用了胚胎期胰岛进行了研究。

材料和方法

一、样本的采取和胰岛细胞的分离培养

实验所用标本为死亡2小时以内的水囊引产胎儿，胎龄7～8个月，按常规无菌取出胰腺制备胰岛细胞^〔3〕。胶原酶V型为Sigma公司产品，活性为510u/mg。

二、人胚胎胰岛细胞培养上清的制备

将胰岛细胞浓度为5×10⁵/ml的细胞悬液，种入24孔板，加入不同浓度rhIFNγ(10-350u/ml)，同时设相应的对照组，培养48小时后收获上清，测定IL-6、胰岛素和胰升血糖素的含量。

三、IL-6生物活性检测

IL-6生物活性检测按文献^〔3〕进行。IL-6依赖细胞株MH60.BSF-2由日本大阪大学细胞工学中心惠赠。rhIL-6为本室产品，已用美国NIH IL-6标准品进行标定。用MTT比色法测定A570-630值，用概率单位法计算各样本不同稀释度的生物反应率，最终计算出IL-6的生物效价(mU/ml)。

四、胰岛素和胰升血糖素测定

用北京原子能研究所提供的放射免疫测定盒测定。

五、IL-6单克隆抗体中和活性测定

IL-6单抗为本室制备，纯化后纯度为98%以上，经实验证明与rhTNF、rhIFN、rhGM-CSF、rhG-CSF和rhIL-2均无交叉反应。在rhIFNγ刺激的胰岛培养上清中，加入不同浓度的IL-6单抗(0.2-25μg/ml)，用rhIL-6 40U/ml作为阳性对照。每个样品设三个平行孔，用MTT法测定中和活性，中和活性以百分数(%)表示结果。

六、胰岛细胞IL-6 RNA斑点杂交

1.IL-6 cDNA探针的制备：IL-6 cDNA探针为本室产品，制备方法参见文献^〔3〕。

2.胰岛细胞RNA的提取：采用异硫氰酸胍(GIT)方法^〔3〕。

3.探针标记和RNA斑点杂交均按文献^〔3〕进行。

结果

一、rhIFNγ对胚胎胰岛产生IL-6的影响

rhIFNγ刺激的人胚胎胰岛分泌IL-6的能力明显增强。当rhIFNγ浓度在100u/ml时，上清IL-6的含量达高峰，为对照组的3.24倍，当rhIFNγ的浓度在200u/ml时，上清IL-6含量反而降低，仅为对照组的2.2倍(图1)。提示经rhIFNγ刺激的人胚胎胰岛培养上清IL-6含量在一定范围内表现出明显的剂量依赖关系(图1)。

图1不同浓度rhIFNγ作用48小时后对人胚胎胰岛IL-6分泌的影响

Fig 1Effectof48hr-culturewithrhIFNγ on human fetal islet IL-6 production

二、rhIFNγ对胚胎胰岛分泌胰岛素的影响

rhIFNγ刺激的人胚胎胰岛培养上清中胰岛素含量有所下降，当rhIFNγ的浓度在100u/ml时，上清胰岛素含量比对照组降低19.3%，而胞内胰岛素含量则比对照组升高11%(图2)。

图2不同浓度rhIFNγ作用48小时后对人胚胎胰岛素释放和胞浆胰岛素含量的影响

Fig 1Effectof48hr-culturewith rhIFNγ on human fetal islet insulin release and islet insulin

三、rhIFNγ对胚胎胰岛分泌胰升血糖素的影响

rhIFNγ刺激的人胚胎胰岛培养上清中胰升血糖素含量明显升高，当rhIFNγ浓度为100u/ml时，胰升血糖素分泌量增加至对照组的2.3倍，当rhIFNγ浓度为200u/ml时，胰升血糖素含量达高峰，为对照组的3.2倍；当rhIFNγ浓度再继续增加时，胰升血糖素含量升高不明显。提示IFN可呈剂量依赖性促进胰升血糖素分泌(图3)。

图3不同浓度rhIFNγ作用48小时后人胚胎胰岛胰升血糖素分泌状况

Fig 3Effectof48hr-culturewith rhIFNγ on human fetal islet glucagon secretion

四、IL-6单抗对rhIFNγ处理后的人胚胎胰岛培养上清中IL-6的中和效应

IL-6单抗对rhIFNγ处理的胰岛和对照组胰岛的培养上清中IL-6存在中和作用，表明rhIFNγ刺激组中IL-6含量高于对照组(图4)。

图4IL-6单抗对rhIFNγ处理组和对照组人胚胎胰岛培养上清IL-6的中和效应

Fig 4 NeutralizationofIL-6in islet supernatant from control group or rhIFNγ-treated group by IL-6 monoclonal antibody

五、IL-6 cDNA探针与rhIFNγ处理的胚胎胰岛RNA的斑点杂交

用生物素标记的IL-6 cDNA探针分别与体外培养的胰岛细胞和rhIFNγ处理的胰岛细胞RNA的斑点杂交，显示rhIFNγ刺激的胰岛RNA中含有高浓度的IL-6 mRNA，含量高于对照组，进一步提示在rhIFNγ刺激情况下胰岛细胞转录IL-6 mRNA的量明显增高(图5)。