关键词： 肿瘤坏死因子；促甲状腺素；细胞内钙；甲状腺

【摘要】目的观察TNF-α对甲状腺细胞肌醇脂质/钙离子(Ins/Ca²⁺)系统的作用。方法利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察TNF-α对鼠甲状腺FRTL-5细胞内Ca²⁺的影响。实验前细胞以不含TSH的5H(5种激素)培养液培养3天，将待测细胞以Fluo-3负载，分别加入不同浓度的TNF-α，以LSCM扫描(488nm)测定细胞内Ca²⁺，观察TNF-α的作用。结果1.TNF-α可降低FRTL-5细胞内基础的Ca²⁺水平，其效应随TNF-α浓度的增加而增强。2.TNF-α可抑制TSH刺激甲状腺FRTL-5细胞Ca²⁺升高的效应。结论TNF-α可以通过抑制甲状腺细胞Ins/Ca²⁺系统发挥其抑制效应。

Effect of tumor necrosis factor on the cytosolic Ca²⁺ of rat thyroid FRTL-5 cellsBa jianming,Luo Guochun,Pan Changyu,et al.General Hospital of PLA,Beijing,100853

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of tumor necrosis factor-α (TNF-α) on the inositol phosphate (Ins)/Ca²⁺ cascade in thyroid cells.MethodsThe cultured rat thyroid FRTL-5 cells, loaded with Ca²⁺ probe Fluo-3, were exposed to different concentration of TNF-α. the changes of cytosolic Ca²⁺ induced by TNF-α in fRTL-5 cells were observed by laser scanning confocal microscope (LSCM).Results TNF-α led to a decrease of the basal and TSH stimulated levels of cytosolic Ca²⁺ of FRTL-5 cells in a dose-dependent manner.ConclusionTNF-α had a inhibitory effect on Ins/Ca²⁺ cascade in thyroid cells.

【Key words】Tumor necrosis factorThyrotropinCytosolic calciumThyroid

(Chin J Endocrinol Metab, 1998,14:183-185)

激素等对甲状腺细胞的调控主要通过腺苷酸环化酶-环磷酸腺苷(cAMPase-cAMP)系统(以下简称AC系统)和肌醇脂质/钙离子(Ins/Ca²⁺)系统两个信息途径，前者通过影响cAMP的产生而发挥效应，后者通过细胞内Ca²⁺变化而发挥效应。研究细胞内Ca²⁺变化是了解Ins/Ca²⁺系统调控功能的重要指标。肿瘤坏死因子(TNF)对甲状腺功能有抑制作用。为进一步探讨TNF-α抑制甲状腺功能的机理，我们利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)，观察TNF-α对Fluo-3荧光标记的鼠甲状腺FRTL-5细胞内Ca²⁺的作用。

材料和方法

一、材料

TNF-α系军事医学科学院基础医学研究所惠赠。胰岛素、转铁蛋白、生长抑素，氢化可的松、甘氨酸(gly)-组氨酸(his)-赖氨酸(lys)、牛促甲状腺素(TSH)和改良F12培养基为Sigma产品。Fluo-3乙酰甲酯(Fluo-3AM)系美国分子探针公司产品。LSCM(INSIGHT plus)系美国Maridin仪器公司产品。

二、方法

1.实验分组：(1)TNF-α对细胞Ca²⁺的作用：实验时加入不同浓度的TNF-α(10³U/L，10⁴U/L和10⁵U/L)。(2)联合用药的作用：①实验时先加TSH，再加TNF-α；②实验前预先加入TNF-α(10⁵U/L)，室温放置10分钟，实验时加入TSH(5U/L)，观察细胞因子的干预对TSH作用的影响。

2.细胞培养：细胞培养液配制成含TSH的6种激素培养液(6H培养液)和不含TSH的5H培养液，将FRTL-5细胞接种于96孔板，每孔约2×10⁴个细胞，于接种后4～6天进行实验。实验前细胞再以5H培养液培养3天。

3.细胞内Ca²⁺测定：待测细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2次，加入10μmol/L fluo-3AM，于37℃温育50分钟。将Fluo-3负载的细胞置于INSIGHT Plus倒置显微镜，以488nm波长的氩离子激光扫描，可得到FRTL-5细胞的荧光图像。圈定预定观察的细胞，以6～10秒的间隔连续扫描，总时间为6～10分钟。根据需要在扫描前及扫描过程中加不同浓度的TNF-α。扫描所得一系列荧光图像经LSCM附带的INSIGHT-IQ分析软件进行分析处理，可得到细胞内Ca²⁺变化的时间效应(相对荧光强度值)曲线。实验时设定相同的激光扫描强度、增益等参数，以保证不同批次实验的稳定性。每组实验重复2次以上。

结果

一、TNF-α对FRTL-5细胞内Ca²⁺的作用

TNF-α可降低FRTL-5细胞基础的Ca²⁺水平。TNF-α10³U/L可轻度降低细胞内Ca²⁺水平，其效应随TNF-α浓度的增加而增强，10⁴U/L和10⁵U/L均可使细胞内Ca²⁺明显降低(图1)。TNF-α降低FRTL-5细胞内Ca²⁺水平的模式包括开始数十秒内的快速下降及随后的缓慢下降，或维持在较低的水平。

二、TNF-α对TSH刺激的FRTL-5细胞内Ca²⁺的作用

TNF-α还可降低TSH(5U/L)刺激后细胞内升高的Ca²⁺(图2a)，将测定孔培养液中预先加入TNF-α10⁵U/L(10分钟)，则TSH(5U/L)刺激不能再使细胞内Ca²⁺水平升高(图2b)。

讨论

Ins/Ca²⁺系统代谢的主要途径是在磷脂酶C(PLC)的作用下，磷脂酰肌醇二磷酸(PIP₂)分解为肌醇三磷酸(IP₃)和二酰甘油(DG)两个第二信使。IP₃的作用主要是介导细胞内Ca²⁺的动员^〔1〕，它与细胞器质膜上的IP₃受体结合后，使Ca²⁺由细胞内钙库释放，导致细胞内Ca²⁺浓度升高。此外，细胞内Ca²⁺的增加也部分来源于细胞外Ca²⁺内流。因此，受体介导的细胞内Ca²⁺变化是Ins/Ca²⁺系统调节的中心环节。

LSCM系用独特的共聚焦光学系统，使分辨率明显提高。利用LSCM，可对单个培养的细胞进行实时Ca²⁺变化的监测。Fluo-3是一种单波长可见激光激发的Ca²⁺敏感的荧光探针，它以Fluo-3AM的形式通过细胞膜进入细胞浆内，在细胞内酯酶的作用下经水解去除AM基，成为游离形式的Fluo-3，与游离的Ca²⁺结合，在488nm波长的氩离子激光激发下则发出很强的荧光。其荧光强度随与Ca²⁺

图1不同浓度TNF-α对FRTL-5细胞内Ca²⁺的作用

fig 1 Effect of different concentration of TNF-α on cytosolic Ca²⁺ in FRTL-5 cells

(荧光强度代表相对Ca²⁺浓度，箭头为加药时刻)

(The fluorescence intensity represents the concen tration of Ca²⁺, the arrow points to the time of adding drugs)

图2TNF-α对TSH刺激FRTL-5细胞内Ca²⁺的作用

Fig 2 Effect of TNF-α on cytosolic Ca²⁺ stimulated by TSH in FRTL-s cells

(荧光强度代表相对Ca²⁺浓度，箭头为加药时刻)

(The fluorescence intensity represents the concen tration of Ca²⁺, the arrow points to the time of adding drugs)

a.实验时先加TSH，再加入TNF-α

b.实验前预先加入TNF-α10⁵U/L，放置10分钟，再加TSH作用

a.Add TSH first, then add TNF-α

b.Add 10⁵U/L TNF-α first,10 minutes later add TSH结合的数量及Ca²⁺的浓度而改变。

TNF-α可抑制甲状腺细胞¹²⁵碘(¹²⁵I)的转运，I型甲状腺5’脱碘作用^〔2〕，并可抑制人甲状腺细胞甲状腺球蛋白(TG)和cAMP生成等^〔3〕。此外，TNF-α还可增强白细胞介素-1β(IL-1β)抑制TG和cAMP生成的作用。动物实验表明皮下注射TNF-α后可使大鼠T₃和T₄水平降低。临床上输注TNF-α治疗T细胞淋巴瘤患者可引起持久性甲状腺功能低下^〔4〕。这些研究均表明，TNF-α对甲状腺细胞有抑制作用，其抑制效应可能是通过抑制甲状腺激素合成的多个环节而实现的，其中包括碘的摄取、转运及TG的合成等。TNF-α对甲状腺细胞cAMP产生有抑制作用，提示TNF-α可通过抑制AC系统而发挥其效应。本研究证实TNF-α可降低FRTL-5细胞内Ca²⁺水平，说明TNF-α对甲状腺细胞Ins/Ca²⁺系统也有抑制作用。此外，TSH主要通过AC系统调节甲状腺功能，亦可激活甲状腺Ins/Ca²⁺系统，具有动员甲状腺细胞内Ca²⁺的作用，使细胞内Ca²⁺浓度升高^〔5，6〕，而TNF-α可抑制TSH刺激的FRTL-5细胞内Ca²⁺水平，这些结果表明TNF-α可直接或间接对抗TSH而抑制甲状腺细胞Ins/Ca²⁺