甾体5α-还原酶^〔1〕是定位于靶细胞微粒体上的膜蛋白，依赖还原型辅酶II(NADPH)作为供氢体，催化一系列甾体底物上Δ^4，5双键的还原作用，并使C-5位上的氢加成到α位上^〔2〕。甾体5α-还原酶有I型和II型区分，两者各有不同的最适pH值，前者为7～9，后者为5.5^〔3〕。该酶不可逆地催化睾丸酮(T)转为生理活性更强的双氢睾丸酮(DHT)^〔4〕。DHT被认为是良性前列腺增生症(Benign prostatic hyperplsia，BPH)的主要病因^〔5〕，抑制该酶活性，减少DHT生成，可能是BPH非手术治疗的主要途径^〔6〕。为了克服测定该酶活性通常所采用的同位素方法难以避免的缺憾，我们创建了简便快捷、经济实用的分光光度计测定方法。

一、材料与方法

1.Tris缓冲液配方：Tris 1214mg，EDTA-Na₂ 18mg,MgCl₂*6H₂O1020mg,二羟基乙醇40mg，NaCl 2.92g，蔗糖45g，并加蒸馏水至1000ml。用盐酸调pH至7.0。

2.甾体5α-还原酶制备：取3只雌性Sprague-Dawely大白鼠(体重301±11克，由中国科学院上海实验动物中心提供)，禁食一夜后取肝脏浸入上述Tris缓冲液中，于0℃条件下匀浆，依次作10000g30min和105000g 1hr离心，制备出作为甾体5α-还原酶载体的肝脏微粒体悬液，置于-70℃冰箱备用，如此可保存至少1个月。

3.试剂与仪器：(1)睾丸酮：Sigma化学公司产，用无水乙醇(AR)溶解经Tris缓冲液稀释，至反应时最终为0、4、5、6、8、12、24和40μmol/L系列浓度，其中0浓度为空白对照。(2)NADPH：Sigma化学公司产，用Tris缓冲液配制，至反应时最终浓度为22μmol/L。(3)紫外光栅分光光度计：型号：752，上海第三分析仪器厂生产。

4.实验方法及步骤：将系列浓度T、甾体5α-还原酶制备液、NADPH和Tris缓冲液一起作37℃连续孵育，用紫外光栅分光光度计在340nm处连续测定NADPH的特征吸收波长OD值的时间变化曲线。根据NADPH标准曲线折算出作为酶学反应底物NADPH10min内的浓度下降速率(μmol*L^-1*min^-1)，扣除空白对照管的下降速率(nmol*L^-1*min^-1)，即为酶活性^〔7〕。进一步以各浓度管中酶活性对T浓度通过GraphPAD inPlot (GraphPAD Softwar Inc.)统计软件，再由Lineweaver-Burk倒数作图法求出大白鼠肝脏甾体5α-还原酶米氏常数Km值^〔8〕。

二、结果

1.NADPH标准曲线

配制NADPH浓度系列测定OD_340nm值，绘制标准曲线。在实验前、中、后分别作相同的标准曲线，合并后得方程OD_340nm=0.004857×NADPH(μmol/L)，r=0.9971。

2.NADPH(OD_340nm)浓度下降曲线及酶活性测定

在37℃孵育时，测定T各浓度管中OD_340nm连续下降值，可以绘制下降曲线图，发现各曲线起始段近似直线，故取前10min内各点作直线回归分析得彼此的下降率，并以此分别减去空白对照管的下降率，所得数据即为酶活性。结果T为4、5、6、8、12、24和40μmol/L各浓度管的酶活性(v)分别为0.2110±0.0095、0.2218±0.0134、0.2446±0.0043、0.2641±0.0055、0.3079±0.0049、0.3340±0.0122和0.3623±0.0264μmol*L^-1*min^-1。将上述两组数据经Lineweaver-Burk倒数法作图，得直线方程为Y=9.0784X+2.5756，r=0.9940(Y轴：1/v;X轴：1/T)，由此计算出大白鼠肝脏甾体5α-还原酶的米氏常数Km=3524.8nmol/L。

三、讨论

在T向DHT的转化过程中，NADPH是必不可少的供氢体^〔9〕，同时它也可能作为其它反应的供氢体，是一种非特异性的还原型辅酶^〔10〕，因此在实验中设置空白对照组尤为重要，以便测定本底值。在本实验过程中，可以清楚地观察到空白对照组的NADPH含量轻微地直线下降，实验组中实测数据扣除这种下降率后才为真实结果。

该方法与国内外一般所采用的同位素法相比较为简便快捷、准确可靠。实施同位素测定方法过程中^〔11〕，除了本实验步骤外，尚需将T进行同位素标记，孵育后进行薄板层析及刮板后作同位素计数，步骤多耗时长，相反本实验方法则简便快捷易操作。另外，诸如同位素标定和测定时、层析板处理过程中随机测量误差及系统误差难以避免。在简单的酶反应中，产物的生成速率应该等于底物的分解速率^〔8〕。同位素法在37℃孵育30min终止反应后进行产物〔³H〕-DHT测定，求其平均生成速率，以代表酶的活性，实际上是一个30min内的平均概念，不是酶学反应的初速率。而分光光度计法连续测定反应体系中NADPH在反应初始10min内的下降速率，通过直线回归计算出底物NADPH的分解速率，更贴近酶学反应的初速率，即酶活性。反应的起始10min的线型几乎是直线，而30min内的线型已经是曲线了。因此，分光光度计法更准确可靠。

将两种方法进行比较，同位素法所用试剂除了分光光度计法所用的之外，尚需将T进行同位素标记，还有薄板层析及同位素计数时所需的一系列试剂和设备，无形中增加了实验成本。不仅费用高，而且需要测定仪器精确，复杂的操作程序需要精良的技术。所以，分光光度计法显得较为经济实用。

本实验方法可以进一步发展为治疗BPH药物甾体5α-还原酶抑制剂的体外筛选模型。

参考文献

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2Metcalf BW, Holt DA, Levy MA, et al. potent inhibition of human steroid 5α-reductase(EC 1.3,1.30) by 3-androstene-3-carboxylic acids. Bioorg Chem, 1989,17:372.

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4Tenover JS. Prostates, pates, and pimples: the potential medical uses of steroid 5α-reductase inhibitors. Endocrinol Metab Clin North Am, 1991,20:893.

5Horton R. Editorial: benign prostatic hyperplasia: new insights. J Clin Endocrinol Metab, 1995,74:504A.

6Celler J. Therapeutic controversies: clinical treatment of benign prostatic hyperplasia. J Clin Endocrinol Metab,1995,80:745.

7Guilbault GG. Handbook of enzymatic methods of analysis. New York and Basel: marcel Dekker Inc, 1976:99～100.

8Guilbault GG. Enzymatic methods of analysis. London: Pergamon Press Inc., 1970:185～180.

9Metcalf BW, Holt DA, Levy MA, et al. communication: potent inhibition of human steroid 5α-reductase(EC 1.3,1.30) by3-androstene-3-carboxylicacids. Bioorganic Chemistry,1989,17:372.

10张昌颖. 中国医学百科全书—生物化学.上海：上海科学技术出版社，1989：192～193.

11崔毓桂，张桂元. 正常成年男性5α-还原酶活性的测定.生殖医学杂志. 1995，4(1)：11.

(收稿：1996-10-03修回：1997-03-24)