关键词： 孕酮；骨钙素；基因；成骨细胞

【摘要】目的观察孕激素对离体成骨细胞骨钙素基因表达及其合成的影响。方法胎鼠头盖骨成骨细胞在含有不同浓度孕酮的培养基中培养约20天。培养不同时期的骨钙素mRNA含量及骨钙素的生成量通过Northern印迹杂交及放免的方法测定。结果孕酮刺激骨钙素基因表达及其合成。其对mRNA表达的最大作用可达对照组的2倍以上。激素的作用呈时间及剂量依赖性。骨钙素mRNA表达及其生成的增加见于培养的中、晚期阶段，提示孕激素对成熟的成骨细胞更具潜能。此外，所选用的4种浓度的孕酮以浓度为10^-6mol/L时作用最明显。结论孕酮从基因水平调节离体胎鼠成骨细胞骨钙素的生成，这种调节呈现时间及剂量依赖。

Progesterone increases osteocalcin production in vitro by regulating osteocalcin gene expressionChen Lulu,Yu Dalin,Niels T. Foged. Department of Endocrinology,Union Hospital,Tongji Medical University,Wuhan,430022

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of progestin on the gene expression and production of osteocalcin in vitro in fetal rat calvarial osteoblasts.MethodsFetal rat calvarial osteoblasts were cultured in the medium with different concentrations of progesterone for nearly 20 days. Osteocalcin mRNA and the amount of osteocalcin in the conditioned medium were determined by northern blot and RIA analysis at different periods of culture.ResultsProgesterone stimulated osteocalcin gene expression and production. In progesterone-treated cultures the maximal expression of gene was 2 times higher than the control. The effect of the hormone was time and dose-dependent. The amount of osteocalcin in the conditioned medium and the osteocalcin mRNA were increased in the middle and late periods of culture. In addition, 10^-6mol/L progesterone acted more significantely on both gene expression and production of osteocalcin than the rest three doses of hormone.ConclusionProgesterone was involved directly in osteocalcin production by regulating gene expression and this effect of progesterone was time and dose-dependent.

【Key words】ProgesteroneOsteocalcinGeneOsteoblast

(Chin J Endocrinol Metab, 1998, 14:190～192)

骨钙素是一含有r-羧基谷氨酸的蛋白质，由成骨细胞生成。它是成熟骨骨基质中丰富的非胶原蛋白之一。尽管骨钙素的生理功能至今尚不清楚，但血清中骨钙素的水平直接反映骨转化中成骨的情况^〔1〕。骨钙素的合成主要受几种钙调节激素的影响，如活性维生素D₃，甲状旁腺素，糖皮质激素等。尽管临床观察已证实孕激素具有增加骨形成的作用^〔2，3〕，但孕激素是否也参与骨钙素合成的调节至今不甚清楚。为此，本文通过胎鼠头盖骨成骨细胞的培养观察孕酮对骨钙素合成的影响及其机制。

材料和方法

一、细胞培养

原代细胞按前述的方法^〔4〕从21天龄的SD胎鼠头盖骨分离所得。存活的细胞分别接种于80cm²培养瓶及6孔培养板中，接种密度为0.2×10⁴个细胞/cm²。培养液为不含苯酚的α-MEM，含10%的经炭预处理过的胎牛血清及抗生素。细胞被置于37℃，饱和湿度，5%CO₂培养箱中培养24小时，然后用含有50μg/ml抗坏血酸及10mmol/L β-磷酸甘油及前述各种成份的α-MEM换去原培养液。实验组的培养液中另加入10^-6mol/L孕酮(Progesterone)，部分实验为10^-9～10^-6mol/L孕酮，所选用的孕酮浓度是参照文献中已报道具有调节作用的浓度，其后每周换相应培养液两次。

所用培养液、血清、抗生素等购于Gibco(Life Technologies, European Divison)，药品购于Sigma(St. Louis, Mo)。

二、培养液中骨钙素含量的测定

培养在6孔培养板中的细胞用于观察骨钙素分泌量。所用孕酮为10^-6mol/L。第5、7、9、11、13、15、17天的培养液收集后立即贮存于-80℃。于测定当天取出标本，室温解冻后立即测定。样本中的骨钙素含量用鼠骨钙素RIA药盒(Biomedical Technologies Inc, Stoughton, MA)测得。

三、Northern印迹杂交分析

用于mRNA分析的样本来源于两组培养细胞。一组培养时间及所用激素浓度同上述骨钙素含量测定的实验，用于观察孕酮对培养的不同时期骨钙素基因表达的影响。细胞收集时间基本同上。另一组为加有10^-9～10^-6mol/L的孕酮，在实验的第11天收集细胞以观察不同剂量孕酮的影响。RNA分离及杂交过程参见^〔5〕。样本中的骨钙素mRNA用一特异的完整编码鼠类骨钙素cDNA序列的寡核苷酸探针(5'-TGCCCTCCTGCTTGGACATGAAGG-3')所测定。寡核苷酸探针用γ-³²ATP做末端标记。为校正各样本上样的差异，杂交膜用³²P末端标记的28 S RNA寡核苷酸探针再杂交。mRNA的含量通过Molecular Dynamics Phosphor Imager SF测定。

结果

离体胎鼠头盖骨成骨细胞在培养第5天见细胞融合。第7天出现稚型骨小结。骨小结在11天左

图1孕酮对培养的不同时间成骨细胞骨钙素生成的影响

Fig 1Effect of progesterone on osteocalcin production by osteoblast at different culture time

●：激素组Progesterone group；○：对照组Control group；^*P＜0.01

图2定量分析所示孕酮对不同时间骨钙素mRNA表达的影响

Fig 2Quantitative analysis showed the effect of progesterone on osteocalcin mRNA expression at different culture time

●：激素组Progesterone group；○：对照组Control group；^**P＜0.01，^*P＜0.05

图3不同剂量孕酮对骨钙素mRNA表达的影响

Fig 3Effect of different concentration of progesterone on osteocalcin mRNA expression

^*P＜0.01

右完全形成，从第13天起培养中便可观察到骨小结的逐渐矿化。第17天中止实验。

最早能在培养液中测得骨钙素是在培养第7天。随后其含量逐渐增加，培养第13天达高峰，第17天下降至最初水平。实验组显示，10^-6mol/L孕酮能增加培养液中骨钙素的量，其作用呈时间依赖性。培养第10天左右开始，培养液中骨钙素含量较对照组明显增加，直至第15天后方逐渐降至对照组水平。骨钙素增加的量在上述各时间组中大致相似，平均约为11%(P＜0.01)(图1)。骨钙素mRNA表达的出现略早于培养液中所能测到骨钙素的时间。第5天标本的检测可见到微量的骨钙素mRNA。以后，mRNA表达逐渐增加并呈持续升高趋势，直到实验结束(第17天)仍无明显减少。定量分析显示，孕酮对mRNA的诱导作用亦仅见于培养的第9～13天，与培养液所测定骨钙素的结果基本平行。略为不同的是，激素组骨钙素mRNA表达在第9天增加最显著，约为对照组的3倍(P＜0.01)(图2)。

不同浓度激素作用的结果表明，孕酮对骨钙素mRNA的表达呈剂量依赖性。当剂量为10^-6mol/L时作用最明显。随着加入培养中孕酮浓度的减少，其刺激作用减弱，10^-9mol/L孕酮所诱导产生的mRNA量基本接近对照组。定量分析显示，所选用的不同浓度的孕酮均增加mRNA的表达，与对照组比较，激素组mRNA量的增加约为1.5～2.3倍。经统计学分析发现，只有激素浓度为10^-6mol/L时，mRNA增加的量具有极显著性差异(P＜0.01)(图3)。

讨论

孕激素作为绝经后骨质疏松症激素替代治疗药物之一，其对骨的影响越来越引起人们的注意。临床观察已发现，孕激素可有效地防止绝经后骨的丢失^〔2，3〕。尽管数年前Eriksen等已首次报道在成骨细胞上存在有可诱导的孕激素受体^〔6〕，但孕激素对骨细胞直接影响的研究仍很缺乏。本研究观察了孕酮对骨钙素生成的影响。结果提示，孕酮不仅增加培养液中骨钙素的含量，同时亦增加骨钙素mRNA的表达。由此可以看出，孕酮增加骨钙素的合成是通过基因水平的调节所达到的。孕酮对骨钙素mRNA的诱导呈剂量依赖关系，当浓度为10^-6mol/L时骨钙素mRNA表达的增加最明显。此外<