关键词： 胰岛素样生长因子；基因；淋巴结；免疫功能

【摘要】目的观察胰岛素样生长因子(IGFs)mRNA在人正常淋巴结的表达与分布，探讨IGFs与免疫系统功能的关系。方法采用地高辛标记人IGFs10个反义RNA探针和原位杂交的方法。结果发现IGFs基因主要在淋巴结间质的网状细胞表达，IGF-I、IGFBP2和IGFBP3阳性表达细胞在淋巴结较均匀的分布，IGF-IIR多分布于外皮质区，IGFBP4和IGFBP5 mRNA阳性表达多见于皮质深层。结论在淋巴结IGFs主要以旁分泌的形式产生，其对于免疫功能的维持可能具有重要意义。

Expression and distribution of insulin-like growth factors genes in human normal lymph nodesYang yi,Chen Lian,Zhang Hongzhi,et al.Children's Hospital,Shanghai Medical university,Shanghai,200032

【Abstract】ObjectiveTo observe the expression and distribution of insulin-like growth factors (IGFs) genes in human normal lymph nodes.MethodsIGFs mRNA in lymph nodes were detected by in situ hybridization with Digoxin labeled iGFs riboprobes.ResultsMost of the IGFs genes were transcribed in reticular cells. IGF-I, IGFBP2 and IGFBP3 mRNA were distributed all over the lymph nodes. IGF-IIR was mainly expressed in the outer cortex. IGFBP4 and IGFBP5 mRNA expression cells were observed in deep cortex.ConclusionThe data suggest that in lymph nodes IGFs are produced and function in a paracrine-autocrine fashion. They may play an important role in maintenance of immune system functions.

【Key words】Insulin-like growth factorsGenesLymph nodesImmune functions

(Chin J Endocrinol Metab,1998,14:180-182)

胰岛素样生长因子(Insulin-Like Growth Factors, IGFs)是人体重要而作用最广泛的内分泌因子之一。为了深入研究IGFs对人体免疫系统功能的影响与调节，我们采用地高辛标记IGFs反义RNA探针和原位杂交的方法，系统检测观察了IGF两种多肽、两类受体和六种结合蛋白基因在人体淋巴结的表达与分布，探讨其在免疫发育和功能调节中的作用。现将结果报道如下。

材料和方法

一、淋巴结来源与标本制备

来自本院外科手术剪除的正常肠系膜淋巴结。新鲜组织立即浸入4%多聚甲醛固定液，4℃放置6～8小时，以含15%蔗糖PBS漂洗后，OCT包埋，-70℃冻存，杂交前冰冻切片，片厚10μm。

二、探针来源与标记

人胰岛素样生长因子I和II，I类和II类受体以及结合蛋白1-6(hIGF-I、-II、-IR、-IIR、BP1-6)10个cDNA探针均由德国慕尼黑大学儿童医院W.Kiess博士惠赠。采用德国宝灵曼公司的DIG rNA Labeling Kit，转录标记上述10种反义RNA探针。

三、原位杂交

组织切片顺次经盐酸，TritonX-100，蛋白酶K(20μg/ml,37℃30')，乙酸酐处理后，预杂交采用50%甲酰胺，2×SSC，37℃2小时，然后加上含5ng/μl dIG标记的探针的杂交液(0.01mol/L Tris-HCl pH7.5, 1×Denhardt's,2×SSC,50%甲酰胺，0.5%SDS，5mg/ml焦磷酸钠，250μg/ml鲑精DNA)42℃，杂交过夜。杂交反应结束后，对组织切片进行充分漂洗，免疫显色反应使用德国宝灵曼公司的DIG nucleic Acid Detection Kit。

结果

原位杂交的结果显示IGF-I mRNA阳性表达细胞在淋巴结间质，主要为广泛分布的网状细胞(图1)。IGF-II探针杂交未见阳性表达细胞。IGF-IR mRNA转录水平很低，仅在近淋巴结门的髓质网状细胞有弱阳性表达。IGF-IIR基因在淋巴结中的淋巴细胞和间质细胞均有表达，尤以成熟B淋巴细胞集中的“帽状区”和副皮质区表达较高(图2)。六种结合蛋白基因在淋巴结都有表达，IGFBP1 mRNA阳性表达细胞呈不规则树突状，分布在生发中心周围的副皮质区。IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4和IGFBP5基因表达都在网状细胞，其中

图1原位杂交IGF-I mRNA阳性分布于淋巴结网状细胞(NBT)×100

fig 1 Positive IGF-I mRNA was distributed in reticular cells of lymph node. In-situ hybridization (NBT)×100

图2原位杂交IGF-IIR mRNA阳性分布于淋巴小结“帽状区”和副皮质区(NBT)×100

Fig 2Positive iGF-IIR mRNA was distributed in the lymph nodule. In-situ hybridization (NBT)×100

iGFBP2和IGFBP3 mRNA阳性表达细胞较均匀地分布在整个淋巴结(图3)，而IGFBP4和IGFBP5mRNA阳性表达细胞则主要分布在生发中心周围(图4)。IGFBP6基因在淋巴细胞和间质细胞都有表达，其阳性表达细胞团呈灶状分布在副皮质区。

图3原位杂交IGFBP2 mRNA阳性分布于淋巴结网状细胞(NBT)×100

Fig 3Positive iGFBP2 mRNA was distributed in reticular cells of lymph node. In-situ hybridization (NBT)×100

图4原位杂交IGFBP5 mRNA阳性分布于淋巴小结周围(NBT)×100

Fig 4 Positive IGFBP5 mRNA was distributed around the lymph nodules. In-situ hybridization (NBT)×100

讨论

内分泌-免疫调节网络是一个十分复杂而又备受关注的研究领域，已有许多研究结果提示IGFs对于免疫系统发育及其功能维持具有重要的作用^〔1〕，但对其作用的途径和机理还有待深入研究和阐明。淋巴结是机体体液免疫和细胞免疫的免疫细胞重要的活动场所。研究IGFs基因在淋巴结的表达与分布，有助于进一步阐明IGFs对免疫系统功能的影响及其机制。

IGF-I作为人体重要的内分泌激素之一，具有广泛的促进增殖分化和代谢调节作用。淋巴结内广泛分布的网状细胞交联成网构成淋巴结的支架，对免疫细胞起着支持和营养作用。我们对人正常淋巴结原位杂交的研究结果显示IGF-I基因有丰富的表达，其阳性表达细胞主要为分布在淋巴结间质的网状细胞。这一发现说明在淋巴结IGF-I主要以旁分泌的形式产生，对被其包绕的免疫细胞施加影响。这种局部自分泌或旁分泌产生的IGF-I可能具有更重要的调节作用。

实验结果证实人外周血淋巴细胞表达IGF受体(IGF-IR)^〔2，3〕，此受体在T淋巴细胞的表达略高于B淋巴细胞。我们以前对B细胞来源的细胞株IM-9的研究表明，IGF-IIR的表达显著高于IGF-IR^〔4〕。从我们对淋巴结原位杂交的结果可见IGF-IR mRNA表达很低，而IGF-IIR表达较高，这可能是由于淋巴结中B淋巴细胞较为丰富。两类IGF受体的生理功能虽不相同，但它们对IGF-I和IGF-II的亲合力是相似的。IGF受体在淋巴结的表达与分布表明淋巴结也是IGFs产生和作用的靶器官。

IGF-IIR是一种多功能受体，它除了与IGF-II结合外，还具有与6-磷酸甘露糖结合的位点，参与溶酶体酸性水解酶的激活与代谢过程。Rom的研究报道人单核巨噬细胞表达IGF-IIR，认为其在细胞生理代谢中可能起着细胞内转运蛋白质的作用^〔5〕。淋巴结作为产生特异性体液免疫的重要场所之一，本研究显示IGF-IIR在成熟B淋巴细胞集中的“帽状区”和间质巨噬细胞较丰富的表达，这可能与免疫球蛋白的产生和巨噬细胞加工处理抗原过程中细胞内蛋白质的代谢与转运有关。

IGF结合蛋白(IGFBPs)是IGFs的运输和储存形式，IGFs通常是与结合蛋白一起产生和分泌，因而IGFBPs对于调节游离IGFs的浓度及其与受体的结合起着重要作用^〔6〕。我们的研究结果表明IGFBP1-6 mRNA在人正常淋巴结都有表达，其中IGFBP2、3基因表达水平较高，并且与IGF-I基因阳性表达细胞的分布是一致的，主要在淋巴结中广泛分布的网状细胞，这进一步提示在淋巴结IGF-I是以旁分泌的形式产生。

IGFBPs的产生有一定组织特异性。我们的结果显示IGFBP4、5 mRNA阳性表达的网状细胞主要分布在T细胞丰富的副皮质区和生发中心周围。T细胞识别抗原后在副皮质区内分裂增生，网状细胞有形成微环境诱导T起始细胞分裂分化的作用。我们对胸腺的观察也发现IGFBP4、5 mRNA表达丰富，提示IGFBP4、5在T细胞的自分泌和局部旁分泌可能对其功能活动的维持与调节有重要作用。

总之，我们的研究发现IGF-I和六种IGF结合蛋白基因在人正常淋巴结有丰富的表达，这些基因的阳性表达主要分布于淋巴结间质的网状细胞，提示IGFs在淋巴结以局部旁分泌的形式产生和发挥作用。IGF受体基因在淋巴结的表达说明淋巴结也是IGF作用的靶器官。此外，IGF-IIR基因在成熟B细胞和巨噬细胞较丰富的表达，可能与IGF-IIR的蛋白质加工和转运功能有关，从而参与淋巴结免疫球蛋白合成和抗原加工过程的调节。这些结果显示，IGF基因在淋巴结的表达与分布对其免疫生<