关键词： 1型糖尿病；发病机理；谷氨酸脱羧酶自身抗体

【摘要】目的探讨1型糖尿病胰岛素缺乏机理及GAD-Ab对胰岛细胞结构及功能的影响。方法以改良的放射配体法筛选1型糖尿病患者GAD-Ab阳性血清，以亲和层析法从该血清中分离纯化GAD-Ab，以免疫荧光法观察GAD-Ab与β-细胞的结合；将纯化的GAD-Ab及/或补体加入人胎胰岛细胞培养体系。结果GAD-Ab能够与β-细胞结合，并使培养胰岛细胞的胰岛素释放量减少；透射电镜观察，加GAD-Ab组β-细胞胞浆颗粒减少；同时加入补体组β-细胞的细胞膜被破坏。结论1型糖尿病患者血清GAD-Ab在体外能够抑制培养的人胎胰岛β-细胞的胰岛素合成和释放，并且有补体依赖性细胞毒作用。

Effectofglutamicaciddecarboxylaseautoantiboyon insulin secretionWang jianmin,Zhou Zhiguang,Wu Hanwen.Institute of Metabolism & endocrinology,Hunan Medical University,Changsha,410011

【Abstract】ObjectiveTo study the mechanism of insulin insufficiency in type 1 diabetes mellitus and to investigate the effect of glutamic acid decarboxylase autoantiboy (GAD-Ab) on structure and function of pancreatic islet cells.MethodsRadioligand assay of GAD-Ab was used to select the positive sera of GAD-Ab in type 1 diabetes patients and affinity chromatography was used to purify GAD-Ab from the positive sera. Indirect immunofluorescent technique was used to observe the binding of GAD-Ab to islet beta cells. Cultured islet beta cells were incubated with GAD-Ab and/or complements and the released insulin was measured by radioimmunoassay. The structure of islet beta cells was observed with transmission electron microscope.Results The amount of released insulin in group C (incubated with GAD-Ab) was lower than those of the group A (control) and B (incubated with complement; both P＜0.01); but it was higher than that of group D (incubated with GAD-Ab and complement) (P＜0.01). there were no differences between the values of groups A and B (P＞0.05). granules in the cells of group C (incubated with GAD-Ab) were fewer than those in groups A (control) and group B (incubated with complement). In group D(incubated with GAD-Ab and complement) not only the granules were fewer, but also the cell membrane was distroyed.ConclusionGAD-Ab had influences both on insulin synthesis and release, it also had the complement-dependent cytotoxicity to human fetal islet beta cells cultured in vitro.

【Key words】Tyep1 diabetes mellitusPathogenesisGlutamic acid decarboxylase autoantibody

(Chin J Endocrinol Metab, 1998,14：168-171)

1型糖尿病是一种器官特异性自身免疫性疾病。已经发现的自身抗体有胰岛素自身抗体(IAA)、胰岛细胞抗体(ICA)、胰岛细胞表面抗体(ICSA)和谷氨酸脱羧酶自身抗体(GAD-Ab)等二十多种；然而，这些抗体是胰岛细胞破坏的原因还是结果，至今仍无定论。GAD-Ab是近年来发现一种新的1型糖尿病自身抗体，可在绝大多数初发1型糖尿病患者和高危人群中检出，在1型糖尿病动物模型(非肥胖型糖尿病倾向小鼠，即NOD小鼠)的众多自身抗体中出现最早、对1型糖尿病的诊断及预报价值最高；因而，多数学者认为GAD是1型糖尿病的始动抗原，从而受到越来越多的关注^〔1-3〕。为了探讨人GAD-Ab对人胰岛细胞的作用，本文用纯化的人GAD-Ab(IgG)和人胎胰岛细胞进行研究，结果表明，GAD-Ab在体外能够破坏人胎胰岛细胞的结构和功能，造成胰岛素缺乏。现报告如下。

材料和方法

一、谷氨酸脱羧酶自身抗体检测

参考Petersen等^〔4〕的方法并加以改良，简述如下。

1.试管内转录和翻译生产标记抗原(³⁵S-GAD)。转录体系内主要含T7RNA多聚酶，GAD₆₅ cDNA及NTP等，依照供货商(Promega)提供的反应条件进行试管内转录和翻译³⁵S-GAD标记抗原。37℃孵育1小时，再加热至67℃10min，随后冷存备用。翻译体系含无蛋氨酸的兔网织红细胞裂解液，2μg dNA，³⁵S-蛋氨酸0.8mCi/ml，总反应体积50μl。用溶液〔含50mM naH₂PO₄,3mM二巯基苏糖醇(DTT)，1mM磷酸吡哆醛，0.5%牛血清白蛋白，pH=7.4〕将翻译物³⁵S-GAD₆₅稀释至450μl，过NAP5柱(Pharmacia)，100μl一份，收集后用作GAD-Ab检测的示踪剂。

2.放射配体分析法(RLA)检测谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)：将待测血清用TBST〔50mM tris,150mM NaCl,1%(vol/vol)吐温20，pH=7.2〕稀释后与上述制备(试管内转录和翻译)的³⁵S-GAD一起，在1.5ml eppendorf管中4℃孵育过夜后，每管加入7.5mg蛋白A琼脂糖凝胶(Pharmacia)，再4℃孵育，轻摇2小时。用TBST洗3次，弃上清留沉淀，加闪烁液1ml/管，液闪仪(Wallac1409)测cpm，每份样品均做2管，标准对照(阳性和阴性)做4管；阳性判断标准：样品cpm值＞正常对照均值+2个标准差被认为是阳性。

二、亲和层析分离纯化GAD-Ab(IgG)

从1型糖尿病患者中筛选出GAD-Ab阳性，胰岛素抗体和ICA阴性之血清样本作为GAD-Ab(IgG)的来源。酶免法测ICA，依照试剂盒(Biomerica, inc；USA)的使用说明进行。放免法测胰岛素抗体(华西医科大学糖尿病科技开发研究所试剂盒)。自制蛋白A凝胶柱(1ml)，连接于快速蛋白质液相层析仪(FPLC，Pharmacia)，进行亲合层析。将血清离心10000rpm,10min；用Buffer a(1.5M甘氨酸—氢氧化钠，3.0M氯化钠pH=8.9)将样品稀释1倍。用PBS(Phosphate buffered Saline)悬浮蛋白A凝胶(美国生命技术公司)，装柱。设定液体流速为0.5ml/min，检测波长280nm。用5倍柱体的Buffer a平衡柱体。每次上样500μl。用Buffer B(0.1M枸橼酸—氢氧化钠，pH=4.0)洗脱。每管收集3min，每支管内预先加150μl buffer D(含1.0M Tirs-HCL,pH=9.0)。用Buffer C(含0.1M枸橼酸—氢氧化钠，pH=3.0)将柱体清洗至基线回恢复零位(280nm,UV.)；用Buffer a平衡柱体，开始下一个层析周期。

三、补体制备

取出生后第3周的日本大耳白幼兔，心脏采血，无菌操作。37℃保温，血凝后离心，取上清过滤除菌，多份混合，测补体效价CH50=10.45单位，-60℃冻存备用。

四、胰岛细胞培养

参考胡远峰等报告的方法^〔5〕，简述如下。取水囊引产胚胎，娩出后立即无菌取胰，去除胰外组织，Hank's液清洗，剪成1～2mm³之碎片，Hank's洗3次，加入V型胶原酶(Sigma,0.5mg/ml,pH=7.6)，38℃水浴中振荡消化8～10分钟，用冷培养液(RPMI1640+10%FCS)终止消化，如此反复消化数次，直至完全消化。分离、洗涤消化物，用培养液制成细胞悬液。细胞培养液为RPMI1640，含15%灭活新生牛血清，10mM烟酰胺，1mM丙酮酸钠，8mM碳酸氢钠，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素，pH7.2。置CO₂培养箱(Shell lab,U.S.A)，37℃，95%空气，5%CO₂，饱和湿度，培养24小时后转皿，48小时后碘乙酸处理，隔日换半量培养液，倒置显微镜观察。放免法测胰岛素(华西医大糖尿病科技开发研究所试剂盒)。

五、间接免疫荧光法观察GAD-Ab与胰岛细胞结合

将分离的人胎胰岛细胞悬液涂于玻片上，空气干燥，甲醛固定，加GAD-Ab(阳性血清分离出之IgG)，对照组加正常人IgG(GAD-Ab,ICA和IAA均阴性者)，37℃，饱和湿度，反应30分钟，洗涤后再加羊抗人IgG荧光抗体(军科院微生物流行病研究室)反应30分钟，洗涤后荧光显微镜(Nikon)观察。

六、检测GAD-Ab对胰岛细胞胰岛素分泌功能的影响

将培养第7天的胰岛细胞更换液体，先用低糖(葡萄糖，5.6mmol/L，上海试剂二厂)培养液孵育2小时，换液并加GAD-Ab及补体，孵育2小时；然后再换液，加含高糖(24.5mmol/L)和茶碱的(10mmol/L，上海试剂二厂)的培养液，37℃孵2小时，每次加入新培养液之前均用Hank's液洗3次，取培养上清测胰岛素含量。实验分组见附表。

七、透射电镜观察培养胰岛β细胞的结构变化

八、统计学处理：双侧性t检验比较不同实验组之间的胰岛素分泌量之差别。

结果

一、一份试管内翻译反应在凝胶过滤纯化后的常规定量为2.5～3×10⁶cpm，可进行80～100份放射配体分析(RLA)。应用不同的阳性血清分析结果显示，本分析方法的组内变异为6.3%～7.8%；组间变异为8.2%～9.1%。以样品cpm值大于对照组cpm均值+2s为阳性标准，15例初发1型糖尿病中有10例阳性，占67%。

二、蛋白A凝胶亲合层析纯化GAD-Ab(IgG)具有较高的纯度，连接于FPLC后是快速方便的有效方法。每毫升血清可纯化出3～5mg igG；纯度为87.3%，只含微量的IgM(3.2%)和IgA(5.6%)。

三、免疫荧光分析