关键词： 谷氨酸脱羧酶；基因表达；ELISA

【摘要】目的为获得足量的、可供实验研究和临床应用的谷氨酸脱羧酶(GAD65)抗原。方法将GAD65基因的cDNA正确地重组到表达型载体pGEX-3X中，并通过原核细胞进行诱导表达，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定表达产物分子量，间接ELISA法证实其免疫原性。结果表达产物分子量约为63.23KD，在误差允许范围(＜8%)内，与GAD65蛋白分子量相近，间接ELISA显示表达产物与1型糖尿病病人血清发生明显的显色反应，证明其具有免疫原性。结论运用基因工程技术获得的表达产物为重组GAD65抗原。这一抗原的获得，将有助于1型糖尿病的预测、预防、鉴别诊断以及免疫治疗等方面的研究。

The expression of glutamic acid decarboxylase gene in vitroWu rui,Cai Jun,Zhao Chong,et al.Institute of Endocrinology,Tianjin Medical university,Tianjin,300070

【Abstract】ObjectiveTo get the glutamic acid decarboxylase (GAD65) antigen which can be used in experimental study and clinical application.MethodscDNA for GAD65 gene was inserted into the expression vector, and its expression in e.coli.DH5α was induced. The molecular weight of expression product was determined by SDS-PAGE and immunogenicity of expression product was ascertained by ELISA.ResultsThe sequence analysis confirmed that GAD65 gene had been correctly inserted into pGEX-3X. The molecular weight of the expression product was approximately63.23KD, which was within the permitted error (＜8%) and similar to that of GAD65 antigen. Indirect ELISA showed that the obvious color reaction appeared after the expression products were associated with the diabetic serum. It proved that the expression products had expected immunogenicity.ConclusionThe expression products obtained by the method of gene engineering are recombinant gAD65 antigen and may be used in experimental study and clinical application for diabetes mellitus.

【Key words】Glutamic acid decarboxylaseGene expressionELISA

(Chin J Endocrinol Metab, 1998,14：82-84)

谷氨酸脱羧酶(Glutamic acid decarboxylase, GAD)是胰岛细胞的主要自身抗原，其异构体GAD65被认为是引发1型糖尿病自身免疫机制的重要因素，在初发1型糖尿病病人血清中约70%～80%含有识别GAD65抗原的抗体，而在健康人群及2型糖尿病病人中GAD65抗体的检出率不足2%^〔1，2〕。检测1型糖尿病病人血清中抗GAD65抗体，对早期诊断1型糖尿病及糖尿病分型均具有重要的参考价值。由于鼠脑和人胰GAD65的氨基酸序列同源性高达96%以上，具有很强的免疫交叉反应^〔3〕，所以，我们在完成鼠脑GAD65基因克隆之后，又构建了它的表达型质粒，并导入原核细胞中诱导表达，对表达产物的免疫原性进行鉴定，为进一步获得高效表达的重组GAD65蛋白，有助于1型糖尿病的早期筛查鉴别诊断和防治。

材料和方法

一、材料

1.试剂和仪器：pGEX-3X及宿主菌E.coli.DH5α为本室保存；T₄-DNA连接酶、各种限制性内切酶、IPTG、ELISA检测试剂及MODEL sA测序仪为BRL公司产品；DNA测序试剂购自Promega公司；Σ960酶联仪产自Metertech公司；pGEX-3X测序引物由北京微生物研究所合成；γ-³²P-dATP购自北京亚辉公司；其它化学试剂均为进口或国产分析纯级产品。

2.血清标本的收集：无家族性糖尿病史的正常个体30人，取其混合血清作为对照样本；随机选取以酮症酸中毒为始发症状，OGTT和胰岛素释放试验提示胰岛功能不良，正在使用胰岛素治疗，年龄小于40岁，病程小于2年的糖尿病个体30人，其混合血清作为实验样本。

二、方法

1.GAD65 cDNA表达型质粒的构建：将经序列分析确证后的GAD65基因的扩增产物与载体pGEX-3X连接，转化宿主菌E.coli.DH5α后，通过原位杂交^〔4〕筛选出含重组质粒的阳性菌落，碱法提取质粒^〔4〕，进行酶切鉴定。以重组质粒为模板，测定插入片段接口处的核苷酸顺序。该表达型质粒命名为p3X-GAD65。

2.GAD65基因在原核细胞中的表达：将p3X-GAD65、pGEX-3X分别转化宿主菌E.coli.DH5α，挑取含p3X-GAD65和pGEX-3X的单一菌落及空E.coli.DH5α菌落，分别接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，以1：10稀释培养物后继续培养1小时，加入24μl iPTG(200μg/μl)，诱导5小时。

3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物分子量：菌液于4℃离心(10000g，2分钟)，沉淀中加入上样缓冲液，100℃煮沸3分钟，离心，上清含表达产物。配制T=6%，C=3.3%和5%的分离胶与浓缩胶，进行SDS-PAGE^〔4〕。经固定、染色和脱色，测定表达蛋白带迁移距离，计算相对迁移率(Rf)及分子量(MW)。

4.间接法ELISA鉴定表达产物的免疫原性：诱导培养的菌液于4℃下500g离心15分钟。PBS(pH7.4)悬浮沉淀，超声裂菌，4℃离心(10000g，15分钟)，上清液中含GAD65重组蛋白，以上清液包被酶联板，封闭后在板孔中分别加入10倍稀释的正常人或糖尿病人的混合血清，37℃保温1.5小时，加入HRP标记的山羊抗人IgG抗体，温育后进行显色，观察颜色变化。如果与对照组相比，出现明显的显色反应，即证明表达产物具有预期的抗原性。

结果

一、GAD65 cDNA表达型质粒的构建

将经序列分析后的PCR片段重组入pGEX-3X载体中，经原位杂交筛选出10个阳性菌落，分别培养后经酶切鉴定，有6个为阳性重组质粒。对载体与插入片段正向接口的序列分析表明接口处读码框架正确，无移码突变，不影响表达产物的氨基酸序列(图1)。

图1鼠脑GAD65表达型质粒正向接口处的核酸序列(→：示接口处)

fig 1 Nucleotide sequence of the junction between expression plasmid and GAD65 gene in rat brain (→: the site of junction)

图2鼠脑GAD65基因表达产物的蛋白电泳图

fig 2 8% SDS-PAGE of expression products of GAD65 gene from rat brain

a E.coli.DH5α宿主菌菌体蛋白(对照)

a Host proteins of E.coli DH5α (control)

b pGEX-3X质粒在宿主菌中的表达产物

b Expression product of pGEX-3X within E.coli DH5α

c p3X-GAD65重组质粒在宿主菌中的表达产物

c Expression product of p3X-GAD65 within E.coli DH5α

m₁标准蛋白分子量(磷酸化酶b,94KD)

m₁Protein MW marker (phosphorylase b, 94KD)

m_2，3 标准蛋白分子量(牛血清白蛋白，67KD)

m_2,3 Protein MW marker (bovine serum albumin, 67KD)

二、GAD65编码序列表达产物的电泳分析

(1)SDS-PAGE显示：以单纯宿主菌裂解上清电泳结果为对照，含pGEX-3X质粒的宿主菌在28KD处呈现高表达蛋白带，实为其自身携带的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)基因的表达产物，而携带p3X-GAD65质粒的宿主菌在90KD附近出现高表达区带，为GST和重组GAD65蛋白所构成的融合蛋白(图2)。

(2)估算分子量：根据Weber公式，测算各蛋白带的相对迁移率(Rf)，再通过标准蛋白的相对迁移率计算表达产物分子量，测得融合蛋白总分子量为91.23KD，重组蛋白分子量为63.23KD。通过SDS-PAGE测定蛋白分子量，其允许误差范围为8%，故表达的重组GAD65蛋白的分子量在误差允许范围内，与文献报道一致。

三、表达产物抗原性的鉴定

以pGEX-3X表达产物、E.coli.DH5α菌体蛋白包被孔板，与正常人及病人血清反应，均未见明显显色反应；以p3X-GAD65表达产物包被孔板，加入正常人混合血清结果同前，而与糖尿病病人混合血清温育后，则出现显著的颜色变化。以上结果表明：E.coli.DH5α菌体蛋白、单纯质粒表达的GST与人血清均未发生特异性反应，而p3X-GAD65表达产物因与病人血清中抗GAD65抗体结合，故出现明显颜色改变，证明其具有预期的抗原性。

讨论

利用原核细胞表达外源基因是以发酵方式快速、高效地合成目的蛋白，因而选取合适的原核细胞表达型质粒作为重组载体是基因工程的关键步骤。本实验选用pGEX-3X质粒作为表达载体，可诱导高效表达，其表达产物为融合蛋白，稳定而不易降解，纯化方便，载体自身的表达蛋白GSTI与动物体内异构酶无免<