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摘要目的研究2型糖尿病(DM)患者载脂蛋白(Apo)∈2等位基因与高脂蛋白血症(HLP)的关系。方法选择携∈2的2型DM和非DM患者各24例及∈3/3 2型DM患者50例。采用PCR/ASO探针杂交技术检测ApoE基因。结果①∈2 2型DM组HLP发生率为62.5%.显著高于∈2非DM组(33.3%)及∈3/3 2型DM组(36%)(P＜0.05)。②∈2 2型DM组HLP包括Ⅱb型(n=2)、Ⅲ型(n=7)、Ⅳ型(n=6).而∈2非DM组包括Ⅲ型(n=1)、Ⅳ型(n=7)。③与∈2非DM组相比.∈2 2型DM组及∈3/3 2型DM组总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇显著增高。∈3/3 2型DM组脂蛋白(a)明显高于其它两组。④与∈2 2型DM正常血脂组相比.∈2 2型DM高脂血症组糖化血红蛋白、空腹血糖水平显著增高(P＜0.05)。结论携∈2的2型DM患者.尤其是代谢控制不良者易并发HLP.Apo∈2等位基因可能是2型DM与HLP之间的一个联系因素。
Apo∈2 allele and hyperlipoproteinemia in Chinese type 2 diabetic patients
Xiang Guangda,Jiang Wen,Xia Bangshun,et al
(Dept of Endocrinology,Wuhan General Hospital of Guangzhou Army of PLA,Wuhan 430070)
abstractObjectiveTo study the relationship between Apo∈2 allele and HLP in type 2 diabetic patients.MethodsWe selected 24 type 2 diabetic patients with ∈2 and 24 nondiabetic controls with ∈2 as well as 50 type 2 diabetic patients with ∈3/3.PCP/ASO probe technique was used to determine their ApoE genotypes.Results①The frequency of HLP was significantly higher in type 2 diabetic patients with ∈2 (62.5%) than in nondiabetic controls with ∈2 (33.3%) and type 2 diabetes with ∈3/3 (36%) (P＜0.05).②HLP in type 2 diabetes patients included type Ⅱb (n=2),type Ⅲ (n=7) and type Ⅳ (n=6),whereas HLP in nondiabetic subjects with ∈2 included type Ⅲ (n=1),type Ⅳ (n=7).③TC,TG,LDL-c were significantly higher in type 2 diabetics with ∈2 group than in nondiabeties with ∈2 group.TC,LDL-c,TG levels were higher in type 2 diabetic patients with ∈3/3 than other in nondiabetic controls with ∈2,and Lp(a) levels were higher than other 2 groups.④FBG and HbA1c levels were significantly higher in hyperlipoproteinemia diabetic patients with ∈2 than in normolipodemic diabetic patients with ∈2.ConclusionThe poor diabetic control predisposes Apo ∈2-carrying subjects to HLP (particularly type Ⅲ),and Apo∈2 allele may be one of factors linking diabetes with HLP.
Key wordsApolipoprotein ∈2 alleleHyperlipoproteinemia
载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)主要存在于富含甘油三酯(TG)的脂蛋白中.通过其与低密度脂蛋白(LDL)受体结合.在脂蛋白代谢中起重要作用［1］。其结构基因位点上存在3个常见共显性等位基因∈2、∈3和∈4.分别编码血浆中3种主要ApoE蛋白异型E2、E3和E4.从而可产生6种不同的基因型∈2/2、∈4/2、∈3/2、∈3/3、∈4/3和∈4/4。一般人群中Apo∈2频率(∈2/2、∈3/2、∈4/2)较低(＜10%)［2］。糖尿病(DM).尤其是2型DM患者常并发高脂蛋白血症(HLP)。国外研究［3］显示.2型DM患者Apo E2异型与Ⅲ型、Ⅳ型HLP有关。我们采用PCR/ASO探针杂交技术对这
一课题进行了研究.现报道如下。
对象与方法
一、对象
从近6年来我院就诊的540例2型DM患者中选择携Apo∈2等位基因者24例(年龄40～75岁.平均59±9岁；男13例.女11例)及∈3/3 50例(年龄40～78岁.平均58±10岁；男28例.女22例)。2型DM诊断符合WHO标准。同时选择携∈2的非DM患者24例作为对照.年龄40～74岁.平均57±10岁；男12例.女12例。所有检测对象肝、肾、甲状腺功能正常.且非亲缘关系。采血前半个月停用降血脂药物。HLP诊断分型按WHO标准。
二、方法
1.血脂、血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)测定：禁食12小时后次晨采静脉血.EDTA抗凝及非抗凝血各1管。新鲜标本分离血清后分别上机测定总胆固醇(TC)、TG、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)(变异系数为1%～2%)(酶法)、载脂蛋白(Apo)A1及ApoB(血清透射比浊法)、血糖(FBG)(葡萄糖氧化酶法)。HbA1c采用亲和层析法.脂蛋白a［Lp(a)］采用ELISA法(变异系数为4%～7%)。
2.ApoE基因型检测：①口腔脱落细胞DNA制备按Bolla等报道的方法［4］。②PCR/ASO探针杂交：按Houlston等［5］报道的方法.应用PCR扩增含∈2/∈3和∈3/∈4等位基因位点的基因序列(330bp)(图1)。引物序列如下：
P15′TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA3′和P2 5′TAGCGGCTGGCCGGCCAGGGAG3′。反应体系50μl.DNA扩增按常规方法进行。ASO探针：112位半胱氨酸(Cys)(E3)C25′CAGGCGGCCGCACACGTCCTC3′；112位精氨酸(Arg)(E4)A25′GAGGACGTGCGCGGCCGCCTG3′；158位半胱氨酸(Cys)(E2)C85′CACTGCCAGGCACTTCTGCAG3′；158位精氨酸(Arg)(E3)A8 5′CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG3′；按Houlston等［5］的方法.用γ-32P ATP和T4多核苷酸激酶进行5′末端探针标记.杂交及放射自显影(图2)。
三、统计方法
计数资料比较采用χ2检验.计量资料则用t或F检验.脂蛋白(a)先行对数转换后行F检验。
图1PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱
M：pBR322/Hindf1.1～6为6个个体PCR扩增产物
图2ApoE基因PCR/ASO探针杂交图谱
1.∈2/2(E2/2)158∈2+158∈3-112∈3+112∈4-
2.∈3/2(E3/2)158∈2+158∈3+112∈3+112∈4-
3.∈3/3(E3/3)158∈2-158∈3+112∈3+112∈4-
4.∈4/3(E4/3)158∈2-158∈3+112∈3+112∈4+
5.∈4/2(E4/2)158∈2+158∈3+112∈3+112∈4+
6.∈4/4(E4/4)158∈2-158∈3+112∈3-112∈4+
结果
∈2非DM组Apo∈2/2 2例.∈3/2 19例.∈4/2 3例.BMI 26.0±5.0kg/m2.FBG 5.1±0.8mmol/L。∈2 2型DM组∈2/2 3例.∈3/2 18例.∈4/2 3例.BMI 26.2±4.5kg/m2.FBG 10.16±4.45mmol/L.HbA1c 8.6±2.1%。两组间ApoE基因型频率分布及BMI相似(P＞0.05)。∈2 2型DM组FBG明显高于∈2非DM组(P＜0.001)。∈2非DM患者HLP发生率为33.3%.其中Ⅲ型1例.Ⅳ型7例；∈2 2型DM患者HLP发生率为62.5%.其中Ⅱb型2型.Ⅲ型7例.Ⅳ型6例。与∈2非DM组相比.∈2 2型DM组HLP频率显著增高(P＜0.05)(表1)。此外.2型DM患者中.∈2组HLP频率显著高于∈3/3组(36%)(Ⅱa型2例.Ⅱb型4例.Ⅳ型11例.Ⅴ型1例)(P＜0.05)。∈2 2型DM组TC、TG及LDL-c明显高于∈2非DM组(P＜0.05).∈3/3 2型DM组TC(P＜0.01)、LDL-c、TG(P＜0.05)明显高于∈2非DM组。Lp(a)显著高于其它2组(P＜0.05)(表2)。∈
