关键词： 糖尿病；ICA亚型；弥漫型ICA；边缘型ICA；免疫组化双标；技术

摘要目的在用免疫组化方法大量检测ICA基础上发现 有弥漫型ICA和边缘型ICA两种迥然不同的形态学表现。为探明这两种ICA所着染的细胞类型 及其临床意义，进行了以下实验。方法选取20例弥漫型ICA和20例 边缘型ICA，用免疫组化双标技术鉴定。结果弥漫型ICA着染β、 α两种细胞，边缘型ICA仅着染α细胞。结论经初步统计，弥漫型 ICA多见于1型糖尿病，2型糖尿病边缘型IC A比例高于弥漫型ICA；弥漫型ICA患者发病年龄比边缘型ICA患者轻且发病进程快。这种新的 ICA亚型与抗α细胞抗体的产生以及α细胞受损有关，为进一步探讨α细胞在糖尿病发病机 制中所起的作用提供了一种新的形态学依据。

Immunohistochemical study on ICA subsets and its relation to the islet cellular types

Pan LinLi GuangweiYang Zhaojunet al

（China-Japan Friendship Institute of Clinical Medical Sciences,Beiji ng 100029）

abstractObjectiveTo explore the changes of the two cel lular types,the diffuse pattern and the peripheral pattern,in morphological dist ribution and their clinical significance.Methods20 cases from the above each pattern were chosen and identified by double-labeling immu nohistochemical techniques.ResultsBoth α-cells and β -cell s in pancreatic islet were stained in the diffuse pattern,but only α-cells in the peripheral pattern.ConclusionThe results from our ex periment indicated that the diffuse patterns were more frequently observed in th e patients with type I diabetes mellitus and existed in those patients who were more younger at onset and the course of disease developed more rapidly in compar ison with the peripheral pattern.The diffuse patterns were more frequent in type I DM,and in type Ⅱ DM the frequence of the peripheral patterns was more higher than that of the diffuse pattern.

Key wordsDiabetes mellitusICA subsetDiffuse pattern Peripheral patternImmunoenzymatic double-labe-ling techniques

近年国外学者利用间接免疫荧光双标、多标技术和动物种属差异研究发现ICA 存在异质性。ICA阳性血清使胰岛β细胞和α细胞均着染为全胰岛型(非限制型)，只着染 β细胞为β细胞选择型(限制型)，是否有仅使α细胞着染的ICA亚型尚未见报告。本研究通 过对 大量的临床糖尿病患者ICA检测，发现ICA具有边缘型和弥漫型两种完全不同的形态学表现， 用酶免疫组化双重标记技术进行鉴别，证实了弥漫型ICA着染β、α两种细胞，边缘型ICA仅 着 染α细胞；这种新的ICA亚型与抗α细胞抗体的产生以及α细胞受损有关。上述分型对临床 糖尿病的诊断、预防、治疗以及进一步探讨糖尿病发病机制具有重要意义，现报告如下。

材料和方法

一、材料

1.研究对象：选择经本院内分泌科确诊为糖尿病、ICA检测阳性的弥漫型和边缘型患者血清 各20例，均稀释为1∶32。

2.切片：O型血正常人胰腺石蜡连续切片，4μm厚。

3.免疫组化试剂：①过氧化物酶标记的蛋白A(peroxidase-protein A,POPA Sigma公司产品 )。②碱性磷酸酶标记的链酶亲和素(streptavidin-alkalin phosphatase,SAP)试剂盒(imm unotech,France产品)。③鼠抗人胰岛素单克隆抗体(ZYMED，USA.批号：71139427)。④兔抗 人胰升糖素抗体(ZYMED，USA.批号：00-3118)。

4.显色剂：①DAB(Sigma公司)。②固红(immunotech,France产品)。

二、方法

1.血清的稀释：取以上经本实验室检测证实的糖尿病ICA阳性患者血清，弥漫型和边缘型各2 0例，均用0.01mol/L PBS稀释成1∶32。

2.抗原片的选择：按免疫组化要求制成的O型血正常人胰腺石蜡连续切片4μm厚，每张载玻 片裱贴3个切面胰腺组织(P1、P2、P3)，并经多次ICA检测确认抗原具有均一性和稳定性者均 为理想的抗原片。弥漫型ICA和边缘型ICA分别选择连续切片20张，阴性对照片2张，共计42 张抗原片。

3.操作步骤：①切片常规脱蜡，水洗10分钟；②0.3% H₂O₂氧化15分钟→水洗10分钟； ③0.01mol/L PBS pH7.4洗5分钟×3次；④滴加0.4% BSA 30分钟，进行以下双重标记； ⑤ 第一次标记：3个切面胰腺组织均滴加1∶32的ICA阳性血清(弥漫型和边缘型血清各20例)，4 ℃ 24～48小时(阴性对照以PBS代替患者血清)；⑥0.01mol/L PBS洗5分钟×3次；⑦滴加PO PA液作用3小时；⑧0.01mol/L PBS洗5分钟×3次；⑨0.05mol/L Tris-HCl洗5分钟；10 DAB -H₂O₂显色5～10分钟(显色液配制：0.05g DAB溶于0.05mol Tris-HCl液中，使用前 加100μl 30% H₂O₂)；11PBS洗5分钟×5次(显微镜下观察，着染的ICA阳性细胞胞 浆中均有棕黄色的阳性颗粒沉着)；12第二次标记：P1不标记，P2滴加1∶50兔抗人胰升 糖素抗体50μl，P3滴加鼠抗人胰岛素抗体50μl，置湿盒4℃过夜；130.01mol/L PBS 洗5分钟×3次；14P₂、P₃滴加生物素化Ⅱ抗50μl(即用型)1.5小时；150.01 mol/L PBS洗5分 钟×3次；16P2、P3滴加链酶抗生物素碱性磷酸酶复合物(即用型)1.5小时；170.01 PBS洗5分钟×3次；180.05mol/L Tris-HCl缓冲液浸洗5分钟×3次；19 固红显色 ：P2、P3滴加固红显色液50μl，显微 镜下控制显色3～5分钟(α、β细胞胞浆均有桃红色颗粒沉着)，0.05mol/L Tris-HCl缓冲 液终止显色。

结果

第一次标记：P1、P2、P3均用患者血清标记，ICA阳性细胞胞浆中有棕黄色阳性颗粒沉着。 第二次标记， P2用胰升糖素抗体标记特异性显示α细胞，P3用胰岛素抗体标记特异性显示β细胞，在α 、β细胞胞浆中均有鲜艳的桃红色颗粒与第一次标记呈棕黄色的ICA阳性颗粒，形成鲜明的 颜 色对比，易于观察。若ICA阳性细胞与α、β细胞的特异性抗体不共存在同一细胞浆中，则 胰岛分别显示出棕黄色与桃红色两种细胞；若ICA阳性细胞与α、β细胞的特异性抗体共存 于同一细胞浆中，则出现棕黄和桃红两种颜色颗粒重叠于同一细胞中，胞浆呈棕红色。

边缘型ICA：P1：用患者血清标记，胰岛部分细胞胞浆中有棕黄色阳性颗粒沉着，主要分布 于胰岛周边和毛细血管周围(图1)。P2：用患者血清和胰升糖素抗体双重标记，α细胞胞浆 中有棕黄色、桃红色两种颗粒重叠，细胞分布区域与P1一致(证实了边缘型ICA仅使α细胞着 染，图2)。P3：用患者血清和胰岛素抗体双重标记，棕黄色的ICA阳性细胞与桃红色的β细 胞对比清晰。未见胰岛各细胞胞浆中有棕黄色与桃红色颗粒重叠现象(图3)。

图1边缘型ICA：P1患者血清标记，ICA阳性细胞胞浆 有

棕黄 色阳性颗粒沉着，阳性细胞主要分布于胰岛周边

及毛细血管周围(×200)

弥漫型ICA：P1：用患者血清标记，胰岛大部分细胞胞浆中有棕黄色阳性颗粒沉着，呈弥 漫性分布(图4)。P2、P3：用患者血清和胰升糖素抗体、胰岛素抗体双重标记。α、β细胞 胞浆中均有棕黄色、桃红色两种颗粒重叠。细胞分布区域与P1相同，证实了弥漫型ICA使α 、β细胞均着染(图5、图6)。

图2边缘型ICA：P2患者血清与胰升糖素抗体双重标记。

患者血清标记的ICA阳性细胞胞浆中有棕黄色阳性颗

粒，胰升糖素抗体标记的α细胞胞浆中有桃红色阳性颗粒。

可见桃红色与棕黄色颗粒重叠于α细胞胞浆中呈棕红色，

α细胞分布同图1(×200)

图3边缘型ICA：P3患者血清与胰岛素抗体双重标记。胞浆

呈棕黄色的ICA阳性细胞与胞浆呈桃红色的β细胞

对比清晰。各类细胞胞浆中均未见棕黄色与桃红色颗粒

重叠现象(×200)

讨论

1992年Timsit^［1］首先报道用间接免疫荧光技术分析ICA，发现ICA存在异质性。Gen ov ese^［2］用四重免疫荧光技术、Gianani^［3］对不同动物种属用酶免疫组化分 析，也分别证实ICA存在异质性。同时使α细胞和β细胞均着染称为全胰岛型(非限制型)ICA ；只着染β细胞称为β细胞选择型(限制型)ICA。

本研究在通过对大量<