第四军医大学学报2000年第21卷第2期

张雅萍姬秋和张万会张南雁宋民喜陈健康

摘要: 目的了解细胞凋亡相关蛋白Fas和FasL的表达在桥本甲状腺炎发病机制及病理变化中的作用及意义.方法采用免疫组织化学方法和图像分析，检测17例桥本甲状腺炎患者甲状腺标本中Fas和FasL的表达及分布.结果在桥本甲状腺炎的甲状腺滤泡细胞中Fas和FasL的免疫染色阳性率和免疫染色强度均显著高于非毒性甲状腺组（P＜0.01）.桥本甲状腺炎中Fas和FasL免疫染色强阳性甲状腺滤泡细胞多分布于浸润淋巴滤泡附近，浸润淋巴细胞中Fas,FasL免疫染色较弱.结论桥本甲状腺炎中Fas,FasL在甲状腺滤泡细胞中呈有特征性分布的高表达，浸润淋巴细胞Fas,FasL表达较少，提示甲状腺滤泡细胞可能通过自身表达Fas和FasL产生凋亡，致甲状腺滤泡萎缩、破坏，也可能是形成淋巴滤泡的主要原因之一.

关键词：细胞凋亡；桥本甲状腺炎；Fas；FasL

0引言

桥本甲状腺炎（HT）是器官特异性自身免疫疾病，其发病机理制尚不十分明确.近年来细胞凋亡与自身免疫疾病关系的研究有了长足的进展，普遍认为细胞凋亡在桥本甲状腺炎的发病机制中起重要作用^［1,2］.已证实凋亡相关蛋白Fas与其配体 FasL（Fas ligand）相互作用，可诱导Fas表达细胞凋亡，在维持免疫系统对自身抗原的免疫耐受和组织自身稳定中起重要作用，而HT中有较多的甲状腺滤泡细胞发生凋亡，且多发生于浸润淋巴滤泡附近^［1-3］.因此对桥本甲状腺炎中Fas和FasL表达及分布的研究，将有助于阐明细胞凋亡在桥本甲状腺炎发病机制中的作用.

1材料和方法

1.1材料1989/1997年我院普外科活检及手术的甲状腺标本，经病理诊断为桥本甲状腺炎17(男2，女15)例，年龄26～57(44±11)岁；对照组非毒性甲状腺肿17(男1例，女16)例,年龄26～57(42±12)岁.所有病例均未经过药物治疗. 所有标本经100 mL^．L^-1福尔马林固定,常规石蜡包埋,制成5μm连续切片,贴于预先涂有5 g^．L^-1铬钒明胶的载玻片上,37℃烤箱36 h. 兔抗人Fas和兔抗人FasL多克隆抗体购自北京宝泰克生物科技有限公司;免疫组化ABC试剂盒及DAB购自Sigma公司.

1.2方法ABC技术进行免疫组织化学染色.按免疫组化ABC试剂盒说明书所示步骤染色.免疫阳性产物为棕黄色. 以正常兔血清及PBS替代一抗染色，作为阴性对照.密封片号情况下（单盲），在光学显微镜下对切片染色阳性情况进行半定量评估.观察全片,无免疫染色阳性之标本为“-”，免疫染色阳性细胞较少，且散在分布者为“+”；而免疫染色阳性细胞较多，分布密集者为“”.求出每组中“+”和“”标本所占总例数的百分比为该组标本阳性率.用LEICA Q500MC图像分析系统对染色强度进行定量分析.每张切片随机抽取10个视野，选择合适的门限分割值，测定阳性细胞的平均灰度，计算其均值，再求出每组标本的灰度平均值，灰度值低，说明透光度低，染色强度高.

统计学处理:采用SAS系统对所测的灰度值进行t检验，方差不齐时行t'检验；对所得阳性率进行χ²检验. P＜0.05,相差显著.

2结果

2.1Fas蛋白免疫组织化学染色Fas蛋白免疫染色阳性物质呈棕黄色颗粒，位于NTG和HT甲状腺滤泡细胞的胞质及胞膜上. nTG组Fas蛋白免疫染色阳性率为35%，HT组为94%，显著高于NTG组（P＜0.01）；HT组Fas免疫染色平均灰度值(182±24)显著低于NTG组(203±15),提示其Fas蛋白免疫染色强度显著高于NTG组（P＜0.01）.

NTG中Fas免疫染色阳性细胞，稀疏散在分布，多在小滤泡上，滤泡结构完整，阳性细胞为低柱状,也有扁平状. hT的甲状腺滤泡细胞Fas免疫染色增强,分布不均匀,强阳性细胞较集中分布在靠近浸润淋巴滤泡附近的小滤泡,部分滤泡已萎缩、破坏,失去滤泡结构,无胶质；另一部分小滤泡则结构完整.强阳性细胞多为立方状或低柱状. HT中浸润的淋巴细胞Fas染色阳性较弱或无（Fig1）.

图 1HT中Fas免疫染色强阳性甲状腺滤泡细胞较集中于浸润淋巴滤泡附近；浸润淋巴细胞染色较弱或阴性

fig 1Strongly positive immunostained thyrocytes with

hT for Fas were mainly distributed in follicles adjacent

to lymphocytic infiltrates；staining of infiltrating lymphocytes

for Fas was found to be rather weak or even absent×100

2.2FasL蛋白免疫组织化学染色两组甲状腺滤泡细胞均有FasL蛋白免疫反应阳性物质，位于细胞膜和细胞质内. hT组甲状腺滤泡细胞FasL免疫染色阳性率为82%，显著高于NTG组(47%，P＜0.01）；而平均灰度值(185±18）显著低于NTG组(207±20)，提示染色强度显著高于NTG组(P＜0.01）. nTG中FasL免疫染色阳性的甲状腺滤泡细胞，散在分布.阳性细胞呈低柱状，少数扁平状. HT中FasL免疫染色阳性的甲状腺滤泡细胞，分布不均匀.染色强阳性细胞较集中分布于浸润的淋巴滤泡附近，且大多在小滤泡上，呈立方状或低柱状，可见部分滤泡已萎缩. hT中浸润淋巴细胞FasL染色弱阳性或阴性（Fig 2）.

图2HT中FasL免疫染色强阳性甲状腺滤泡细胞较集中于浸润淋巴滤泡附近. 浸润淋巴细胞染色较弱或阴性

fig 2Strongly positive stained thyrocytes for FasL were mainly distributed

in follicles adjacent to lymphocytic infiltrates.But staining of infiltrating

lymphocytes for FasL was found to be rather weak or even absent×200

3讨论

已证实桥本甲状腺炎(HT)中有较多的甲状腺滤泡细胞发生凋亡，且多发生于浸润淋巴滤泡附近^［1-3］.本实验显示在此区域甲状腺滤泡细胞有Fas和FasL的高表达，与其他作者^［1,4］的报道一致；同时还发现在浸润淋巴细胞中Fas和FasL低表达，与Giordano等^［5］的结果吻合. fas与FasL交联，向靶细胞内传导死亡信号，致Fas表达细胞凋亡，是CTL杀伤靶细胞的一条重要途径.我们的实验结果则提示HT中甲状腺滤泡细胞的破坏，可能是甲状腺滤泡细胞自身通过自分泌和(或)旁分泌方式而凋亡，并非由浸润淋巴细胞以其FasL发挥CTL作用直接杀伤^［6］. hT中浸润淋巴细胞Fas和FasL低表达或不表达，也可能保护其自身免受活化诱导的细胞死亡（AICD）作用杀伤，从而逃避外周克隆剔除和活化淋巴细胞的清除，这是否是造成大量淋巴细胞浸润，形成淋巴滤泡，并产生较多抗甲状腺自身抗体如抗TPO抗体和抗TG抗体的原因之一，有待深入研究.在Lpr和gld小鼠及人类淋巴细胞增生综合征^［7］，由于fas或fasL基因突变，导致Fas和FasL蛋白表达异常，使Fas-FasL机制受阻，活化的T,B淋巴细胞在体内堆积，产生大量自身抗体，可引起自身免疫性疾病；而Batteux等^［8］研究表明，在实验性自身免疫性甲状腺炎，将携带fasL基因的DNA导入浸润T淋巴细胞中，可诱导其发生凋亡，阻止淋巴细胞的浸润，上述文献从不同角度支持了我们的推论.

研究表明，细胞因子如IFN-γ,IL-1β及TNF-α可诱导甲状腺滤泡细胞Fas蛋白的表达^［5,9］，并增强细胞对Fas抗体诱导细胞凋亡的敏感性. ajjan等^［10］报道，在HT甲状腺组织标本中,CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞表达IFN-γ,IL-1β,TNF-α等细胞因子.因此可推测HT的浸润淋巴细胞可以通过细胞因子，使其附近的甲状腺滤泡细胞表达高水平的Fas,FasL，同时又增强其对Fas途径介导凋亡的敏感性,从而产生细胞凋亡.这与我们发现Fas,FasL在淋巴滤泡附近的甲状腺滤泡细胞中高表达相吻合.还有实验表明，从HT患者浸润淋巴细胞分离出来的T淋巴细胞克隆，多为CD8⁺表型^［11］，而CD8⁺T淋巴细胞可采用Fas-FasL途径和穿孔素一颗粒酶两种方式进行其CTL杀伤作用. hT中浸润淋巴细胞可能不通过Fas-FasL途径杀伤甲状腺滤泡细胞，但不除外其通过分泌穿孔素和颗粒酶对附近甲状腺滤泡细胞杀伤的可能.

基金项目:第四军医大学青年基金资助项目(97Y)

作者简介:张雅萍(1963-),女(汉族),河南省巩县人.主治医师,讲师,硕士. Tel.(029)3375217Email.yplb@163.

张雅萍（第四军医大学西京医院内分泌科）姬秋和（生理学教研室,陕西 西安 710033）张万会（第四军医大学西京医院内分泌科）张南雁（第四军医大学西京医院内分泌科)

宋民喜（西安市第四<