关键词： 胰岛素；局灶脑缺血；基因；c-jun

【摘要】目的观察不同剂量胰岛素对高血压大鼠局灶缺血脑组织c-jun基因表达的影响。方法以肾血管性高血压大鼠(RHR)复制大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，采用原位杂交技术检测不同剂量胰岛素组和对照组MCAO后3h脑组织c-jun基因的表达。结果与对照组相比，在缺血侧广泛的大脑皮层，低剂量胰岛素组c-jun mRAN有统计学意义的增加(P＜0.05)，而较高剂量胰岛素组c-jun mRNA增加更为显著(P＜0.01)。结论胰岛素促进缺血脑组织c-jun基因表达可能是其神经保护作用机制之一，而且这种作用呈剂量依赖性。

The effect of insulin on c-jun gene expression in the rat brain with focal ischemia.Wang Yidong,Huang Ruxun,Zeng Musheng,Li Ling, Tao Yuqian.Department of Neurology,Sun Yat-sen Memorial Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Science.107 Yanjiang Xi Road,Guangzhou.510120.Tel:020-81882012-3498

【Abstracts】ObjectiveTo investigate the effect of insulin on c-jun gene expression following focal cerebral ischemia in hypertensive rats.MethodsThe renovascular hypertensive rats(RHR)were divided into 4 groups receiving either insulin only (Group A),insulin plus glucose(Group B and C,dose differently) or normal saline (Group D)immediately after middle cerebral artery occlusion (MCAO).The level of c-jun mRNA was measured by situ hybridization at 3?h after MCAO.ResultsLow or high dose of insulin all increased c-jun expression in ipsilateral cortex following MCAO and c-jun mRAN increased along with elevated insulin dose.ConclusionsThese results indicate that the effect of insulin on c-jun expression may be one of the mechanisms of neuroprotection of insulin,which is dose dependent.

【Key words】InsulinFocal ccrebral ischemia Genesc-jun

大量资料显示胰岛素能减轻脑缺血损害。胰岛素的这种作用并不完全依赖于其降血糖效应^［1，2］。既往局灶性脑缺血研究多选用正常血压、无脑血管病变的动物来进行，而且缺血前已用胰岛素，这与临床实际存在较大差距，得出的结论自然不够客观。原癌基因c-jun是即早基因(immediate early genes)中较具代表性的成员，脑缺血及重灌流能诱导c-jun在脑组织快速而短暂地表达。脑缺血后胰岛素是否能影响c-jun的表达尚未见报道。本研究选用具有慢性高血压、动脉硬化基础的肾血管性高血压大鼠(RHR)复制的大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，在缺血后给予胰岛素，采用原位杂交(ISH)技术观察缺血脑组织c-jun基因表达的变化。

1材料与方法

1.1实验分组与处理采用线栓法把符合下列条件的RHR(采用双肾双夹肾动脉狭窄术^［3］复制的高血压大鼠)30只制备成MCAO模型：①双肾动脉狭窄术后、高血压持续10周以上；②血压达24 kPa或以上；③从未出现脑卒中症状。然后随机分4组：低剂量胰岛素低血糖组(A组)8只，MCAO后即予胰岛素2.1 IU/kg(普通胰岛素与低精蛋白锌胰岛素以1∶2比例分别腹腔注射和皮下注射)，保持血糖于3～4.5 mmol/L；低剂量胰岛素正常血糖组(B组)8只，MCAO后即予胰岛素(剂量和用法同A组)，同时予葡萄糖2 g/kg(50%GS腹腔注射)，保持血糖于正常范围(4.6～10 mmol/L)；高剂量胰岛素正常血糖组(C组)8只，处理基本同B组，仅剂量不同：胰岛素4.5IU/kg，葡萄糖4g/kg；对照组(D组)6只，MCAO后仅予生理盐水4 mL/kg腹腔注射。各组于术前30 min、MCAO后1 h、2 h、3 h取尾血用微量血糖计(Bayer,德国)测血糖，MCAO前后30min分别测血压、直肠温度、血气分析。

1.2c-jun mRNA显示与测量采用c-jun DNA探针(2.0 kb，北京天象人生物工程有限责任公司提供)，地高辛(DIG)标记(DIG DNA标记和检测试剂盒，Cat,No.1093657.购自德国Boehringer Mannheim公司)。各组大鼠在MCAO后3 h处死，迅速断头取脑，尽快冰冻切片，取经前连合冠状切片(5 μm)行原位杂交。杂交过程参照Boehringer Mannheim公司说明。设空白对照实验。杂交后切片进行图像分析(德国Kontron IBAS 2.0全自动图像分析系统)，测定组织中c-jun mRNA平均灰度。

1.3统计学处理全部测量值均用《中国医学百科全书*医学统计学》统计软件包(第二版)(PMES version 2.1)进行处理。

2结果

2.1生理指标测量结果A组在注射胰岛素后1h血糖即下降明显，与其它三组比较，有统计学意义(P均＜0.01)；B组与A组使用同一剂量的胰岛素，但通过同时注射葡萄糖，避免了血糖的下降；C组的胰岛素剂量虽比A、B组高一倍，但由于加大了葡萄糖的用量，也使血糖保持在正常范围。其它生理指标同一指标各组间比较，P值在0.3以上，无统计学意义的差异。

2.2c-jun表达部位和程度c-jun mRNA被诱导出现于缺血侧广泛的大脑皮层(包括主要由大脑前动脉供血的扣带皮层)，染色呈紫蓝色。非缺血侧无c-jun基因表达。空白对照切片亦未见紫蓝染色。A、B、C、D组c-jun mRNA的平均灰度分别为171.82±7.33、172.56±7.91、155.09±7.91、182.58±6.88，A、B、C组分别与D组比较差异显著(P＜0.05)、C组与A、B、D组比较都有统计学意义的差异(P＜0.01)，A、B组之间比较差异不显著(P＞0.05)，说明A、B、C组的c-jun表达均有统计学意义的增加，其中C组的增加更为显著，A、B组间则无差异。

3讨论

采用线栓法复制MCAO模型，无需开颅，不存在对脑的手术损伤，可避免由于脑的直接手术损害对脑组织c-jun表达的影响。本实验中，可能影响结果的生理指标如血压、直肠温度、血气分析在各组间无差异。结果显示，低剂量胰岛素组不论是在轻度低血糖状态还是在正常血糖时c-jun表达均有统计学意义的增加，而增加胰岛素剂量，c-jun mRNA增加更为显著。在同一剂量的胰岛素低血糖组(A组)和正常血糖组(B组)，c-jun表达无差异，说明轻度低血糖状态并没有影响到c-jun表达，提示这两个组与对照组间c-jun表达的差异是由于胰岛素的作用。胰岛素的神经保护作用已有不少报道，但其作用机制尚未清楚。White等推测全脑缺血时胰岛素可能通过促进易损区c-fos、c-jun、hsp-70基因的早期表达，减轻脑缺血损害^［4］。本研究则发现胰岛素能促进高血压大鼠局灶缺血脑组织的c-jun表达，而且胰岛素剂量越大，这种作用越明显。

c-jun表达产物被认为是细胞信息传递通路上的“第三信使”，通过激发后反应基因(late response genes)的表达，将细胞外短时间的刺激转换成长时程的细胞效应。脑缺血早期，脑的总体蛋白合成被严重抑制，即早基因等特殊基因的早期诱导可能对细胞的生存和恢复有重要意义，这些基因的成功诱导有利于神经元耐受缺血和生存下来，若不能诱导或诱导后中途夭折，则可能导致神经元死亡和长时间的变性与退化^［5］。大脑皮层的神经元和胶质细胞均分布较多的胰岛素受体，从血循环转运来的胰岛素，可能通过上述途径促进c-jun表达，对脑缺血起保护作用。

综上所述，可认为胰岛素促进缺血脑组织c-jun基因表达是其神经保护作用的可能机制之一。

参考文献

1Voll CL,Auer RN.Insulin attenuates ischemic brain damage independent of its hypoglycemic effect.J Cereb Blood Flow Metab，1991，11(6)：1006

2周成业，黄如训，曾进胜，等.葡萄糖及胰岛素对高血压大鼠脑梗塞的影响.中国神经精神疾病杂志，1997，23(1)：4

3曾进胜，黄如训.易卒中肾血管性高血压大鼠模型及其应用.中山医科大学学报，1996，17(4)：241

4White BC,Grossman LI,O'Neil BJ,et al.Global brain ischemia and reperfusion.Ann Emerg Med,1996,27(5):588

5Kogure K,Kato H.Altered gene expression in cerebral ischemia.Stroke,1993,24(12):2121