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1材料和方法利用多基因表达技术将BDNF和TH基因同时构建在同一个表达载体GC-hBDNF-P-hTH1-SN上。然后转染病毒包装细胞PA317并感染NIH-3T3细胞，通过BDNF和TH免疫组化筛选，挑选阳性的细胞克隆。将该NIH-3T3-BDNF-hTH1细胞立体定向植入7只PD模型大鼠的毁损侧纹状体内，两个靶点共移植约2×106细胞；对照组7只移植转染空载体的NIH-3T3细胞。移植后2天、4天、1周、2周分别用ABC免疫组化染色，Western blotting等方法来检测外源性BDNF，hTH在NIH-3T3细胞的表达，用HPLC-ECD检测TH活性，用人胚的脊背神经节细胞培养法检测BDNF的活性。
2结果①重组的质粒GC-hBDNF-P-hTH1-SN用Bgl Ⅱ、Xho Ⅰ、EcoRⅠ等限制性内切酶解长度分析结果均有BDNF、HTH1的插入。②Western Blotting显示：外源的BDNF、hTH1同时在PA317细胞内得到表达，PA317-hBDNF-hTH1细胞同时有14.4 kb的BDNF和60 kb的hTH1带。③转染了外源的BDNF、hTH1基因后，经G418筛选后的NIH-3T3细胞，大部分出现了不同程度TH、BDNF免疫阳性反应。用HPLC-ECD法和用人胚的脊背神经节细胞培养法检测分别具有TH和BDNF活性。④ 7只立体定向植入NIH-3T3-hBDNF-hTH1细胞的PD模型大鼠毁损侧纹状体内，绝大多数移植细胞呈BDNF、TH免疫染色阳性反应，1周、2周的切片染色程度基本上相同。对照组未检测到TH和BDNF。
3结论本实验所用的多基因表达载体GCXPXSN为逆转录表达载体，逆转录病毒感染细胞后，能将外源性基因稳定地整合到宿主基因中，有效表达并传递到子代细胞中，因而可以持续稳定地表达外源性基因。我们首次使同一细胞同时表达TH、BDNF，经检测表达的TH及BDNF均具有生物活性。另外还发现，并非每个细胞都能同时表达TH和BDNF，且TH的表达效率要比BDNF高。尽管不是每个基因都能高效表达，但对开展多基因治疗PD及其他疾病无疑是一种有价值的探索。
Fig. 1 Analysis of restrictive enzyme
a:DNA marker, b:Bgl Ⅱ, c:XhoⅠ, d:EcoRⅠ
图1质粒限制性核酸内切酶酶解分析
a:DNA marker, b:Bgl Ⅱ,c:Xho Ⅰ,d:EcoR Ⅰ
Fig. 2 Construction of GC-hBDNF-P-hTH1-SN plasmid
2GC-hBDNF-P-hTH1-SN质粒构建
(1998-10-20收稿)
