［摘要］目的研究新设计的抗骨质疏松药物XW630对成骨细胞碱性磷酸酶基因表达的影响，为其治疗骨代谢性疾病提供理论和实验依据。方法以成骨细胞MC3T3-E₁为体外实验模型，用含有10^-6mol/L浓度的XW630，雌酚酮，四环素及四环素加雌酚酮的细胞培养液DMEM培养细胞，24 h和72 h提取细胞总RNA并与碱性磷酸酶cDNA进行Northern杂交。结果XW630对成骨细胞MC3T3-E₁合成和分泌碱性磷酸酶具有明显的促进作用。结论XW630具有明显的促进成骨作用。

Effect of antiosteoporosis drug XW630 on osteoblast gene expression

Shang Dezhi

（Jinzhou Medical College liaoning Jinzhou 121001）

［Abstract］ Objective To find the effect of a new antiosteoporosis drug XW630 on alkaline phosphatase of gene expression and to support the theoretic and experimental basis for XW630 in treating the bone metabolic disease.Methods The osteoblasts MC3T3-E₁ were cultured in vitro with 10^-6 mol/L XW630 containing culture medium,while estrogen and tetracycline were used as control drugs in the medium.The osteoblasts were cultured for 24 hours and 72 hours,the total RNA of osteoblasts was extracted,the alkaline phosphatase was used as cDNA probe and the Northern blot hybridization was done.Results The mRNA expression of osteoblast alkaline phosphatase could be promoted by XW630.Conclusion The metabolism of osteoblasts could be promoted by XW630.

原发性骨质疏松症是临床上最常见的一种代谢性骨疾病，多发生于绝经后妇女，其特点是在骨代谢过程中，骨吸收和骨形成之间的偶联出现缺陷，与内分泌紊乱、钙吸收不良和废用性有关，雌激素水平下降是骨质疏松症发病的重要原因。研究表明，成骨细胞含有特异性的雌激素受体，雌激素可以直接作用于成骨细胞^［1，2］。雌激素的缺乏使骨对甲状旁腺素(PTH)的敏感性增加，导致骨吸收增加，雌激素缺乏可直接或间接地降低降钙素(CT)的分泌，降低1，25(OH)₂D₃在血液中的含量，从而使骨量丢失^［3］。

四环素曾作为一种广谱抗生素而广泛应用于临床。经过长期的临床实践发现四环素对骨组织具有高度的亲合性，即与骨组织的钙盐结合而沉积于骨组织内，主要沉积在骨的活性部位。最近的研究认为，四环素对病理状况下骨组织的修复具有促进作用，对糖尿病引起的骨质疏松症具有潜在的治疗作用^［4］。

基于对雌激素直接促进骨形成和四环素对骨组织具有极强亲合力的认识，为降低雌激素在子宫、乳腺等非骨组织的浓度，预防和降低雌激素在治疗骨质疏松时所表现的副作用，XW630课题组设计出新型抗骨质疏松药物XW630，即将四环素与雌激素通过桥连接的方式而合成的新化合物。

本研究采用成骨细胞MC3T3-E1作为体外实验模型，加入XW630药物24，72 h，提取细胞总RNA，并与碱性磷酶酶cDNA探针进行狭缝杂交，从分子水平探讨XW630对成骨细胞代谢的影响及其促进成骨功能的机理，为其临床应用提供理论和实验依据。

1材料和方法

1.1材料

新药XW630由华西医科大学药学院合成(中华人民共和国专利号93110919.6’93110939.1)；雌酚酮、四环素：华西医大药学院骨质疏松研究实验室提供。含有碱性磷酸酶cDNA片段的质粒DNA PTA153由章锦才教授惠赠。

1.2方法

细胞培养：以D-MEM加10%小牛血清为培养液，在37℃，5%CO₂浓度，饱和湿度下培养成骨细胞MC3T3-E₁，经传代培养至实验所需数量。

实验分组：以D-MEM培养液分别稀释XW630，雌酚酮，四环素及四环素加雌酚酮至10^-6mol/L的浓度。弃原细胞培养液，换用上述4种药物作细胞培养液继续培养，每组细胞培养10瓶，每瓶细胞加7 ml药物培养液。加药后24 h和72 h终止培养，每次取5瓶细胞提取细胞总RNA。

细胞总RNA的提取及RNA与cDNA杂交：细胞总RNA的提取采用柱提取法(gene company Ltd USA产品，严格按照说明书的步骤完成)，剪取适当大小的尼龙膜，以无菌双蒸水浸湿，再于20×SSC室温浸润1 h，用0.1 mol/L氢氧化钠清洗多孔点膜器，继以无菌双蒸水彻底冲洗，将用20×SSC浸润过的滤纸平铺在点膜器上，再铺上尼龙膜，排除两者之间的气泡，夹紧点膜器，连接真空泵。取10×SSC加满点样孔，抽滤2次。取RNA10μg，依次稀释5倍，即10μg,2μg,0.4μg，甲酰胺20μl，37%甲醛7μl,20×SSC 2μl，混匀，于68℃水浴15 min后冰浴冷却，再加入2倍体积20×SSC 200μl，抽滤，反复2次，继续抽真空使尼龙膜干燥。取下尼龙膜在室温中晾干，置120℃烤箱内30 min，使样品RNA与尼龙膜交联。

将点样的尼龙膜于6×SSC中完全浸润，放入塑料袋中，加入预杂交液4 ml，68℃水浴保温1 h。

取已经DIG标记的actin-β 0.2μg，于100℃沸水浴中变性5 min立即冰浴，加入另外4 ml的杂交液中，并装入另一塑料袋内，迅速将已经过预杂交的尼龙膜转移至塑料袋内，封膜。在68℃水浴摇床内，轻轻振摇12～16 h。

杂交后，以2×SSC和0.1%SDS于脱色摇床上洗2次，每次20 min。用马来酸缓冲液，轻轻冲洗5 min。在30 ml封闭液中孵育30 min。转移至7 ml anti-DIG-AP conjugate(7 mu/ml)溶液中孵育30 min，用30 ml马来酸缓冲液漂洗尼龙膜2次，每次15 min。在7 ml反应缓冲液中平衡2～5 min。将尼龙膜转移至3 ml着色液中，在暗室内孵育16 h。取出尼龙膜，放入50 ml水中5 min以终止反应。将尼龙膜取出放在两张滤纸中间，于暗室内晾干。

待已显色的尼龙膜干燥后，在Beckman CDS200密度扫描仪上，以反射波，0.3 mm窄缝，快速扫描，自动记录。

根据actin-β狭缝杂交后的情况来看，各组细胞总RNA的含量比较一致，以2μg RNA的上样量较为合适。其余各组RNA的点膜，杂交程序同用actin-β探针的杂交。

2结果

在成骨细胞MC3T3-E₁中分别加入XW630、雌酚酮、四环素以及四环素加雌酚酮，培养24 h，结果发现XW630、雌酚酮以及四环素加雌酚酮对成骨细胞碱性磷酸酶(AKP)mRNA的表达具有明显的促进作用；而单纯的四环素不影响成骨细胞碱性磷酸酶mRNA的表达。经狭缝杂交，密度扫描半定量分析表明：XW630加入成骨细胞中培养24 h，可使其碱性磷酸酶mRNA的表达增加3.6倍，雌酚酮与四环素加雌酚酮分别加入成骨细胞培养24 h，可分别使成骨细胞碱性磷酸酶mRNA的表达增加2.8倍和2.6倍。成骨细胞MC3T3-E₁加入药物培养72 h，其碱性磷酸酶mRNA的表达与加药后24 h相比，已明显降低，在整个实验期间，单纯的四环素对成骨细胞碱性磷酸酶mRNA的表达没有明显作用。

图1成骨细胞MC3T3-E₁加入药物培养液

培养24 h，细胞总RNA与碱性磷酸酶

cDNA探针狭缝杂交及密度扫描分析

注：A：对照B：四环素C：四环素加雌酚酮

D：雌酚酮E：XW630

图2成骨细胞MC3T3-E₁加入药物培养液

培养72 h，细胞总RNA与碱性磷酸酶

cDNA探针狭缝杂交及密度扫描分析

注：A：对照B：四环素C：四环素加雌酚酮

D：雌酚酮E：XW630

3讨论

骨质疏松症是老年人的多发病，其骨量减少常随年龄的增长而加重。据美国国立牙科研究所(NIDR)1993报告，在美国目前约有2 000万骨质疏松症患者，其中大部分为女性，在这些患者中约有150万人发生骨折，每年耗费医疗费10亿美元。据日本1980年报告资料，约有400万骨质疏松症患者，其中发生股骨颈骨折者约为10万人^［5］。虽然，目前我国尚无骨质疏松症的统计资料，但我国已跨入老年社会的行列，加之人口基数大，故推算我国目前患骨质疏松症的数目不会少于国外。因此研制一种安全有效地治疗骨质疏松症的方法是国内外学者正在努力探讨的重要课题。

自40年代Albright^［6］在绝经后妇女中首次观察到雌激素缺乏与骨质丢失存在一定联系，并提出雌激素水平下降是绝经后易发生骨质疏松症和骨质疏松性骨折的病因之后。人们从不同角度对雌激素在骨组织生长代谢过程中的作用进行了不断地探索。Lindsay^［7］认为，雌激素的主要作用是减少骨吸收，从而阻止骨量的丢失。Takano-Yamamoto^［8］则认为：切除卵巢后应用雌激素，可增加成骨细胞数量，促进骨形成。Steinber