关键词： 肾；囊肿；一氧化氮；一氧化氮合酶

摘要：目的探讨一氧化氮（NO）过多产生在获得性肾囊肿（ACDK）发生肾癌过程中的作用。方法用高压液相自动分析方法测定16例18份ACDK和12份单纯性肾囊肿囊内液体中NO的代谢产物亚硝酸盐/硝酸盐（NO^-₂/NO^-₃）的含量，同时测定5份ACDK患者血浆NO^-₂/NO^-₃的含量。采用免疫组织化学方法（LSAB法）检测17份ACDK和20例非ACDK肾组织一氧化氮合酶（iNOS）的表达。结果ACDK囊内液NO^-₂/NO^-₃的含量（151.6±64.2μmol/L）明显高于单纯性肾囊肿组（50.1±33.6μmol/L），差异有极显著性（P＜0.001）。其中在相同的5例ACDK患者中囊内液NO^-₂/NO^-₃的浓度明显的高于血浆中的浓度。在免疫组织化学染色（LSAB法）检测肾组织iNOS的表达中，17份ACDK中14例（82%）为阳性。13例正常肾组织和7例非ACDK慢性肾衰的肾组织均无iNOS的表达。结论NO在ACDK囊内液中过多产生有可能是其囊上皮发生肾癌的原因之一。

Nitric oxide and nitric oxide synthase expression in the cystic fluid of acquired cystic disease of kidney

HUANG Xiaobo（Department of Urology, People’s Hospital, Beijing Medical University,

beijing 100044,China）

zHU Jichan（Department of Urology, People’s Hospital, Beijing Medical University,

beijing 100044,China）

wANG Xiaofeng（Department of Urology, People’s Hospital, Beijing Medical University,

beijing 100044,China）

Absrtact：ObjectiveTo evaluate the role of nitric oxide over-production in the oncogenesis of acquired cystic disease of kidney(ACDK).MethodsHigh pressure liquid chromatography (HPLC) was used to assay the NO^-₂/NO^-₃ level in 18 samples of ACDK cystic fluid and in 12 samples of simple renal cyst fluid. Furthermore,5 serum samples from ACDK patients were assayed with the same technique. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression was detected by immunohistochemical method (LSAB) in 17 ACDK renal tissues and in 20 non-ACDK renal tissues.ResultsThe mean contents of NO^-₂/NO^-₃ in ACDK cystic fluid (151.6±64.2μmol/L) was significantly higher than in simple renal cystic fluid (50.1±33.6μmol/L) (P＜0.001). The cystic fluid levels of NO^-₂/NO^-₃ was significantly higher than in serum levels of the same 5 ACDK patients. iNOS expression was positive in 82.4% (14/17) of ACDK patients but none in 13 normal kidney tissues and 7 non-cystic kidney tissues from dialysis patients.

ConclusionsOver-production and accumulation of NO in the cystic fluid of ACDK might be one of the factors of renal cell carcinoma oncogenesis in the native kidney.

Key words：KidneyCystsNitric oxideNitric oxide synthase▲

一氧化氮（NO）在生物体中具有广泛的生理作用，但过多NO的产生可以导致机体细胞DNA的损伤^［1］。最近研究发现在获得性肾囊肿(ACDK)组织中存在DNA损伤^［2］。本研究通过ACDK囊内液中NO水平测定及该肾组织中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）检测，探讨ACDK患者肾癌的发生机理。

材料和方法

一、标本来源

18份ACDK的肾囊液标本来自1996年1月～1998年1月期间共16例ACDK伴肾癌患者的18个肾脏手术标本，其中2例为双侧肾癌。男15例，女1例。年龄33～73岁，平均49岁。血液透析时间6.1～22.4年，平均13.4年。病理证实为全肾呈弥漫性多发囊性变伴肾细胞癌。18个肾脏中多发肾癌为13例，单发5例。肾癌直径0.5～15.0cm。ACDK肾囊液用注射器直接从手术标本抽吸获得。12份单纯肾囊肿囊内液是同期在门诊经皮穿刺抽吸治疗中获得。获得的肾囊液立即用0.22μm的滤网滤过,置-70℃中冻存备用。

上述18个肾脏标本中的17个（其中1个缺失）肾癌旁肾组织作为免疫组化研究对象，另外13例正常肾脏组织和7例非ACDK的慢性肾衰的肾脏组织作为对照。

二、肾囊肿囊内液NO的测定

由于NO在体内不稳定，通常测定其代谢终产物亚硝酸盐（NO^-₂）和硝酸盐（NO^-₃），两者反映检体内的NO水平。根据Griess反应用镉层析柱的方法将标本中NO^-₃还原为NO^-₂，再用高压液相分析仪测定^［3］，整个过程自动化进行，测得结果代表NO^-₂和 NO^-₃水平的总和。同时测定5例ACDK患者血浆NO^-₂/NO^-₃含量作为内参对照。

三、ACDK肾组织iNOS的免疫组化染色LSAB方法

在17个ACDK伴肾癌标本中取其癌旁肾组织，同时对13例正常肾脏组织和7例非ACDK的慢性肾衰的肾脏组织进行iNOS的免疫组化染色。3.5μm切片，常规脱蜡，水化。用0.3%H₂O₂中和过氧化物，10%羊血清封闭，滴加一抗（兔抗鼠iNOS抗体，WAKO,日本）1∶500浓度，室温湿盒中反应60min。二抗采用LSAB试剂盒，各反应30min后用DAB控制染色。核复染，脱水封片。LSAB试剂盒和DAB由DAKO公司提供。选择染色最明显的部位进行显微镜检查，染色细胞＞10%被判定为阳性。

四、统计学方法采用t检验

结果

一、获得性肾囊肿与单纯性肾囊肿囊内液NO^-₂/NO^-₃测定结果

12份单纯性肾囊肿囊内液NO^-₂/NO^-₃浓度为(50.1±33.6)μmol/L，18份获得性肾囊肿囊内液NO^-₂/NO^-₃浓度为(151.6±64.2)μmol/L，明显高于单纯性肾囊肿组，差异有极显著性(P＜0.001)。同时测定的5例ACDK患者血浆NO^-₂/NO^-₃的浓度为(80.6±34.2)μmol/L。在相同的5例患者囊内液体中NO^-₂/NO^-₃的浓度为(137.2±46.6)μmol/L，明显高于血浆中的浓度。

二、获得性肾囊肿的肾组织iNOS的免疫组化检测结果

在17个ACDK肾组织中iNOS染色阳性14个，阳性率82%。其中8个为囊上皮细胞和间质细胞混合阳性，单纯囊上皮阳性和单纯间质细胞阳性分别为4个和2个。阳性着色细胞呈细胞浆染色，细胞核不着色。阳性细胞呈集聚分布，阳性的间质细胞多位于小血管周围，而阳性囊上皮细胞多为单层立方上皮细胞(图1.2)。对照组13例正常肾脏组织和7例非ACDK的慢性肾衰的肾脏组织内偶见iNOS染色阳性细胞，散在分布，染色阳性细胞均＜10%，为阴性。

图1光镜下iNOS免疫组织化学染色(LSAB法)ACDK肾组织阳性间质细胞

图2光镜下iNOS免疫组织化学染色(LSAB法)ACDK肾组织阳性囊肿上皮细胞

讨论

NO是以左旋精氨酸为底物在一氧化氮合酶的作用下合成的一种重要的信号传导分子。诱导型一氧化氮合酶（iNOS）是许多组织细胞在脂多糖和(或)细胞因子的刺激下诱导生成^［4］。透析患者在透析的过程中接触这两种物质致使血浆中NO含量升高^［5］。本研究中发现ACDK囊内液NO水平明显升高，并且高于患者血浆中的浓度。提示其NO的来源除从血液中通过弥散途径之外，肾组织本身也有NO的过多合成。

ACDK多发生于肾小球肾炎后出现慢性肾功能不全的肾脏，其表现为双肾呈弥漫性、多发性的囊性改变。在肾小球肾炎阶段肾组织即有iNOS的表达^［6］。本研究发现ACDK肾组织中间质和上皮细胞均有iNOS表达。提示ACDK囊内液NO蓄积是多种细胞在iNOS的作用下使NO过多生成。iNOS是钙非依赖酶，其作用的结果是产生大量的NO^［7］。正常的NO产生对维持机体内环境稳定有重要的生理作用。过多NO的产生则会引起细胞DNA损伤。NO分子极不稳定，与过氧分子反应生成过氧化氮（ONOO^-），该物质有很强的细胞DN