中华外科杂志2000年第38卷第3期

黄晓波王晓峰朱积川侯树坤东间绂

摘要：目的：观察化学药物大鼠多发肾囊肿伴肾肿瘤模型的诱发情况和DNA损伤标记物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG) 在其肾组织的表达。方法：用2-氨基4,5-二苯噻唑( dPT)和N-亚硝基吗啉( NNM)诱发与人类获得性肾囊肿（ACDK）伴肾癌相似的大鼠动物模型。并用免疫组化方法（LSAB法）检测8-OHdG在大鼠肾组织的表达。结果：在本实验中，NNM组3/10的大鼠诱发肾肿瘤出现。在DPT/NNM组的9只大鼠均发生双侧肾脏多发囊性变化，7/9大鼠有肾肿瘤的发生，其中4例肾肿瘤发生于囊肿上皮细胞并向囊腔内生长。用DPT/NNM诱发大鼠模型的病理改变与人类ACDK极为相似。在上述两实验组的大鼠肾脏组织中发现肾小管上皮、囊肿上皮、间质细胞及肿瘤细胞均有8-OHdG的明显表达。结论：用DPT和NNM能诱发与人类获得性肾囊肿（ACDK）伴肾癌相似的大鼠动物模型，并能造成相似的病理改变和DNA损伤标记物8-OHdG的明显表达，两者可能存在某些相似的发病机制。

关键词：肾，囊性DNA损伤化学，药物

在我们以往的研究中发现人类获得性肾囊肿（acquired cystic disease of the kidney，ACDK）的肾组织中DNA损伤标记物8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG)有明显表达^［1］。为进一步探索ACDK伴肾癌的发病机理，我们用2-氨4,5-二苯噻唑（2-amino-4,5-diphenylthiazole，DPT)和N-亚硝基吗啉（N-nitrosomorpholine，NNM)诱发大鼠多发肾囊肿伴肾肿瘤建立动物模型，以检测DNA损伤标记物8-

oHdG在其肾组织中的表达。

材料与方法

1．动物模型：选30只雄性SD大鼠（Charles river Breeding Laboratories, Wilington, Mass,美国）体重200～250 g（平均236 g）。DPT、 NNM分别由Baxter Healthcare 和Sigma 公司提供。DPT以1%含量混合于饲料中。NNM加入大鼠的饮水中（100 mg/100 ml）。30只SD大鼠分为3组，每组10只。DPT/NNM组：用DPT饲养大鼠贯穿实验的全过程，于第4周开始给NNM饮水，共7周。NNM组：用正常饲料喂养大鼠，于实验的第4周给NNM饮水至第11周。正常对照组：用正常饮水和饲料喂养。

2．标本的制备：诱发实验于第38周至42周结束。乙醚麻醉下处死大鼠，摘取双肾，用生理盐水灌洗肾脏，剖开肾脏置Carnory固定液中固定24 h后石蜡包埋。

3．免疫组化法8-OHdG染色（LSAB法）:4 μm切片常规脱蜡，水和。用0.3% h₂O₂中和过氧化物，10%羊血清封闭，滴加8-OHdG单克隆抗体（Japanese aged Control institute,日本），浓度为5 μg/ml，室温湿盒中反应60 min。二抗采用LSAB试剂盒（DAKO,Japan），各反应30 min后用DAB控制染色。核复染，脱水封片。显微镜检查呈细胞核染色为阳性。

结果

DPT/NNM组中1只大鼠于实验的第8周不明原因死亡，其余9只均发生肾脏多发囊性病变。HE染色显示肾多发囊性病变来源于扩张的肾小管和集合管，囊肿分布于肾脏皮质和髓质。NNM组只有1只大鼠出现单侧，单发肾囊肿。正常组无肾囊肿发生。DPT/NNM组和N～M组均有不同程度的肾小管上皮增生表现。DPT/NNM组的9只大鼠中有7只发生肾肿瘤，其中4例肿瘤来源于肾囊肿上皮并向囊腔内生长。NNM组的10只大鼠中有3只发生肾肿瘤。所有肾肿瘤呈腺瘤样改变，显微镜下未见肿瘤有浸润生长表现。正常对照组无肾囊肿和肾肿瘤发生。

8-OHdG染色结果显示在所有DPT/NNM组和NNM组的大鼠肾组织中均有8-OHdG的明显阳性表达。正常对照组则无表达。8-OHdG染色阳性细胞分布于肾小管上皮细胞，肾囊肿上皮细胞，间质细胞和肾脏肿瘤细胞。

讨论

本研究证实了在DPT诱发大鼠多发肾囊肿的基础上，致癌物NNM可以导致肾肿瘤的发生。这种变化可能是二者协同作用的结果。DPT在动物实验中是肾多发囊肿的经典化学诱导物^［2，3］。它的代谢产物与过氧化物结合作用于细胞的DNA引起DNA的损伤，导致细胞的凋亡和癌的发生^［4］。NNM是亚硝基类致癌物，具有很强的致癌作用。在本实验中大鼠多发肾囊肿伴肾肿瘤的发生机理，可能是DPT引起肾多发囊性变，而NNM是在囊性变的基础上诱发肾肿瘤的发生。DPT/NNM组诱发肾肿瘤的发生率明显高于NNM组，提示二者的协同致癌作用明显增强。NNM在诱发大鼠肝癌的动物实验中被广泛应用^［5］。而在诱发大鼠肾肿瘤尚属首先发现。可能是由于DPT诱发肾多发囊性变导致大鼠处于尿毒症状态，而导致NNM在大鼠体内滞留，并经尿液排泄蓄积于肾囊肿的囊液中，长期作用于肾囊肿的囊壁上皮细胞及肾组织导致肾肿瘤发生的结果。

ACDK是慢性肾功能不全患者经透析得以长期存活后肾脏出现多发性的囊性病变。其肾癌的发生率高于其他器官癌的发生^［6，7］，并且为双侧多发病灶同时出现。本研究所诱发的大鼠多发性肾囊肿伴肾肿瘤的动物模型在病理形态上与人类的ACDK有极为相似之处：（1）多发肾囊肿与肾肿瘤病变出现在同一病理切片中。（2）肿瘤演变过程中的上皮细胞增生，息肉样改变，乳头样瘤和肾肿瘤的形成在同一肾脏同时出现。（3）肾肿瘤的发生向囊腔内生长。（4）上述各种病理改变发生于双侧肾脏。该动物模型的诱发成功为我们进一步研究ACKD及伴发肾癌的发病机理提供了一个实验动物基础。

ACDK伴发肾癌的发病机理目前尚不清楚，其原因除肾衰患者全身机体抗肿瘤免疫功能低下的原因之外，与其局部多发囊肿的形成和囊上皮细胞的增生相关。在我们以往的研究中发现ACDK的肾组织中存在DNA损伤标记物8-OHdG的明显表达^［1］。同时在肾囊肿的囊液中也发现一氧化氮（NO）的含量明显增高和肾组织内NO合成酶的表达^［8］。NO的过度生成会引起DNA的损伤，而导致癌的发生。

8-OHdG是在内源性和外源性的氧化离子作用下使DNA链上的碱基发生变化的产物，它被认为是重要的DNA损伤标记物。其生物学特点是在DNA的复制过程中发生G∶C和T∶A的碱基的错误配对而导致基因的突变^［9，10］。该发现提示8-OHdG的产生是癌发生的重要因素。在本实验的大鼠肾囊肿伴肾肿瘤的组织中8-OHdG在肾小管上皮细胞，肾囊肿上皮细胞，肾间质细胞和肾肿瘤细胞均有明显表达。该结果与我们以往在ACDK肾组织中8-OHdG的免疫组化染色存在相似的表达。这种相似的DNA损伤的存在提示可能存在相同的发病机制。

作者单位：黄晓波100044北京医科大学人民医院泌尿外科

王晓峰100044 北京医科大学人民医院泌尿外科

朱积川100044 北京医科大学人民医院泌尿外科

候树坤100044 北京医科大学人民医院泌尿外科

东间绂日本东京女子医科大学泌尿外科

参考文献

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xydeoxyguanosine in acquired cystic disease of the kidney. Nephron, 1999, 81:458-459.

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［10］Cheng KC, Cahill DS, Kasai H, et al. 8-Hydroxyguanine, an abundant form of o