关键词： 脱噬作用；婴儿；新生；脑缺氧；脑缺血

【摘要】目的研究细胞凋亡在新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBD)中的作用。方法结扎新生7日龄大鼠左颈总动脉后吸8%浓度氧2小时制成HIBD模型，应用透射电镜、苏木素-伊红(HE)染色、原位缺口末端标记(TUNEL)综合研究新生大鼠HIBD后脑细胞的死亡形式。结果缺氧缺血(HI)后电镜清晰地观察到神经细胞凋亡各期的形态变化；HE染色发现HI后0小时左侧纹状体有一些神经元呈凋亡早期的改变；HI后18小时TUNEL染色在左脑皮质及纹状体见到阳性凋亡细胞；HI后2～3天凋亡达高峰；持续至少3周。结论三种方法均表明细胞凋亡为HIBD后神经元的主要死亡形式，也是加重脑损伤的一个因素。

Study on the Ultrastructure of Apoptosis after Cerebral Hypoxia-ischemia in the Neonatal Rat

Sun Guilian,Han Yukun,Li Guanqun.Department of Pediatrics,The 2nd University Hospital,China Medical University,Shenyang 110003

【Abstract】ObjectiveTo assess the potential contribution of apoptosis to neuronal death after hypoxic-ischemic brain damage(HIBD) in the neonate.MethodsThe HIBD model was produced in the traditional model of neonatal hypoxia-ischemia(HI) which subjected 7-old-day Wistar rats to unilateral carotid artery ligation followed by an hypoxic(8% oxygen) episode of 2 hours duration.The patterns of neuronal cell death after cerebral HI injuries were examined in neonatal rat using transmission electron microscopy,Hematoxylin and Eosin(H and E) staining,terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP-biotin nick end labelling(TUNEL) staining.ResultsIt was observed clearly by transmission electron microscopy that cell dying by apoptosis underwent a series of morphologic changes.The results showed that some neurons in striatum revealed early morphological characteristics of apoptosis by H and E staining at 0h after HI.The distribution of positive apoptotic cells was not detected in cortex,striatum of the ipsilateral hemisphere until 18h after HI by TUNEL staining.Apoptosis peaked at 2-3d after HI,and persisted for 3 weeks.ConclusionThree methods suggested that apoptosis was major form of cell death after cerebral HI in the neonatal rat,and was also a factor that exacerbated infarct size after HI.

【Key words】ApoptosisInfant,newbornCerebral anoxiaCerebral ischemia

新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBD)发病机制复杂，其导致继发性神经元死亡的机制还不十分清楚。已知细胞死亡分为凋亡和坏死两种形式，两者在形态及生化特征上有许多不同，以往认为脑缺血后神经元的死亡是一个被动的坏死，最近研究表明脑缺血后神经元死亡有凋亡参与。本研究利用新生大鼠制备HIBD模型，用电镜、苏木素-伊红(HE)染色、原位缺口末端标记(TUNEL)来研究HIBD时细胞的死亡形式。

材料及方法

一、材料

1.7日龄Wistar大鼠，性别不限，体重12～16g，共75只，由本院动物实验室提供。

2.RSS-51W型便携式数字测氧仪，上海产。

3.自制常压缺氧舱，40cm×50cm×60cm,有2个2cm×2cm小孔与外界相通，内有电热毯控制舱温，钠石灰吸收舱内水分和CO₂。

4.程序性细胞死亡检测试剂盒，华美生物工程公司产品，内含末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)、生物素标记的dUTP及亲和素-辣根过氧化物酶等。

二、方法

1.新生大鼠HIBD模型制备：结扎大鼠左侧颈总动脉，恢复2～4小时置于由氮气和空气调节，测氧仪监控的常压缺氧舱内(舱温36±1℃，氧浓度8%)，2小时后取出。分别于HI后0、3、6、18小时、1、2天各处死5只；3天处死10只；7、14、21天各处死5只，取脑后分别固定于10%中性福尔马林缓冲液中或2.5%戊二醛磷缓冲液中。并设单纯缺氧、单纯缺血、假手术及正常鼠各5只做对照。

2.透射电镜检查：每个大脑冠状切成4片，每片再分为4～5块，每块约1cm×1cm×2cm，经2.5%戊二醛及1%饿酸双重固定后进行电镜检查。

3.光镜检查：经10%中性福尔马林缓冲液固定后，以视交叉、乳头体中部、大脑后缘与小脑连接处为切点，将脑冠状切成4片，常规石蜡包埋，切片，6 μm厚，分别进行HE和TUNEL染色，操作见Gavrieli法^［1］，AEC染色，苏木素复染，试验中以右侧脑做自身对照，不加TdT或生物素标记的dUTP做阴性对照，阳性细胞为核和胞浆染成红色。

结果

一、透射电镜观察

电镜下可清楚观察到正常神经细胞及早、中、晚期凋亡细胞。

1.凋亡早期：细胞皱缩、核固缩、核内染色质分布欠均匀，染色质颗粒向异染色质区集中，形成染色质块，电子密度高于正常，核仁消失，核膜尚完整(图1)。

图1早期凋亡细胞(可见细胞及核皱缩，呈不规则形状，

染色质分布不均匀，核仁消失，电镜×6 000)

2.凋亡中期：核膜尚完整，染色质更加致密，均质无结构，电子密度更高。

3.凋亡晚期：染色质凝聚、移动，分布于核周，进而裂解成几个碎片，呈各种形态，此期核膜不平，核孔仍存在(图2)。

图2凋亡晚期细胞(核染色质呈马蹄形，电镜×12 000)

凋亡时除了核改变外，细胞器也有变化，粗面内质网、线粒体、溶酶体等大量增殖，粗面内质网表面部分核糖体脱落，肿胀呈囊泡状，同心圆平行板层状排列，线粒体稍扩张。

细胞最后降解成膜包裹的凋亡小体，常被邻近细胞所吞噬，吞噬了凋亡小体的胶质细胞，其胞浆内有许多大小不等的内含致密染色质或空泡化的线粒体(图3)。有的为膜状凋亡小体，呈髓鞘样结构。

图3吞噬有凋亡小体的胶质细胞(可见内含致密染色质的

凋亡小体()；空泡化线粒体的凋亡小体()，电镜×6 000)

二、HE染色

HI后0小时左脑纹状体有少量脑细胞呈现凋亡早期的改变；HI后3～6小时病变更广泛，皮质也受累；HI后1天在丘脑和海马也见到早期凋亡细胞，并见少许晚期凋亡细胞；HI后2天核碎裂增多，并见许多坏死细胞；HI后3天凋亡达高峰；HI后4天坏死停止，但凋亡仍存在，持续至HI后21天。右侧脑、双侧脑干、小脑及其它各对照组全脑均未见明显病变，偶见到凋亡的细胞。

三、TUNEL染色

HI后18小时在左脑病灶处可见少数阳性细胞；HI后1天在皮质、纹状体、海马、丘脑均见到阳性细胞；HI后2～3天达高峰；直至HI后21天仍可见少许阳性细胞。有两种阳性细胞，一种是凋亡特征(胞体缩小、核固缩、核碎裂、凋亡小体形成)的阳性细胞，另一种是有坏死特征(胞体较大，核膜及核仁不清或浅染色的无凋亡小体)的阳性细胞。

结果发现凋亡细胞多位于病变较重的皮质和纹状体的边缘内带、选择性细胞死亡区、海马和丘脑处；坏死的细胞多位于皮质和纹状体的中心；右侧脑及小脑、脑干、其它对照组全脑均为阴性。

讨论

细胞凋亡即在某些生理或病理性因素诱导下激活膜信号系统，进一步启动有关调控凋亡的程序基因，最终导致细胞按一定程序控制的自我破坏和死亡。凋亡时因核酸内切酶激活导致核小体间双股DNA断裂，使细胞出现特异形态。

本研究应用透射电镜、HE染色及TUNEL法均表明新生大鼠HIBD时脑细胞凋亡与坏死共存，但以凋亡为主，凋亡先于坏死，HI后0小时即有早期的细胞凋亡；HI后2～3天达高峰；HI后2天坏死明显；HI后4天坏死已减少或停止，但凋亡持续至少3周。电镜下清晰地观察到凋亡时突出的变化是细胞核，变化的早、快、多，细胞器也发生变化，早期细胞器增多，以后线粒体、内质网稍肿胀，可能与凋亡细胞自噬，合成凋亡相关蛋白或保护性地合成凋亡相关蛋白的功能抑制物有关^［2］。

细胞凋亡时DNA降解，暴露了新形成的DNA 3’-OH末端，细胞坏死时，DNA随机降解，也暴露-OH末端，TUNEL法利用TdT标记这些断裂的DNA末端，此法结合了DNA片段的<