染色体病是一大类遗传病，由染色体的数目异常或结构异常所致，已发现的染色体病已超过1 000种。现在，还没有有效的方法治疗此类疾病。通过羊膜腔穿刺(amniocentesis, AC)及绒毛膜取样(chorionic villi sampling, CVS)技术获取孕中期羊水中胎儿细胞或孕早期绒毛膜滋养细胞，以细胞遗传学技术及荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization, FISH)技术分析胚胎的染色体组成，筛除异常胚胎，使正常胚胎继续妊娠，有效地减少了染色体病患儿的出生。但是传统的染色体病产前诊断是一种侵入性诊断，有一定的流产率，使部分患者难以接受。另外，对受累胚胎是否行治疗性流产也是悬而未决的伦理学问题之一。这两方面的因素在某种程度上限制了AC和CVS技术的临床应用。体外授精(in vitro fer- tilization, IVF)技术，精子细胞浆内注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)技术，FISH，以及比较基因组杂交(comparative genome hybridization, CGH)技术的出现，使得植入前遗传病诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)成为可能^［1，2］。自从1990年Handyside用聚合酶链反应(PCR)技术完成第1例植入前诊断以来，该领域研究进展迅速^［3］，胚胎染色体异常的植入前诊断更是倍受关注。现将该领域的新进展综述如下。

一、临床取材

植入前获取生殖细胞或胚胎组织的方法主要有3种：极体活检、卵裂球活检及胚细胞活检。

1.极体活检(polar body biopsy)：第一极体及第二极体是卵子发育过程中的产物，其染色体组成可用来判断卵子的染色体成分是否异常。第一极体的活检最好在取卵前6 h内完成，但也有学者认为在取卵前24 h内完成即可。第二极体要从受精卵中取出，但是Verlinsky从受精卵中同时获取了第一、第二极体。极体可用于PCR，也可于固定后行FISH。最近，已经发展到用第二极体移入到去核的卵子中，制备极体的中期分裂相。但是将极体用于染色体分析仅能间接反映卵细胞的组成，不能诊断来自父亲的染色体异常^［4，5］。

2.卵裂球活检(blastomere biopsy)：体外授精后的胚胎通常在体外发育到6细胞至10细胞期，从中取出1～2个卵裂球行染色体分析。对于大多数胚胎来说，可以在体外发展到4～10细胞期，此时的细胞仍处于全能分化期，移去1～2个卵裂球并不会损伤胚胎^［6］。完成诊断后，于授精后第3天可将胚胎移入体内，故不需要行冷冻处理。但由于仅能取到1～2个卵裂细胞，而且在卵裂期(cleavage stage)染色体嵌合现象发生率很高，此时的染色体分析可能代表不了胚的染色体组成^［6，7］。分析2个卵裂球有助于减少这种风险。此外，在卵裂期的细胞很脆弱，极易溶解，在取材的过程中稍不慎，即可使细胞破裂。另一个使此期取材困难的因素是胚发育到8细胞期以后逐渐致密化，细胞彼此之间的界限不清晰，连接紧密，不易分开。用无钙、无镁的培养基有助于细胞分离，便于活检。在4细胞期活检可能会改变内细胞团和极滋养层细胞的比率，从而对胚的发育造成损害。因此，卵裂期取材均在6～10细胞期进行，一般取细胞数不超过25%。

3.囊胚细胞活检(blastocyst biopsy)：囊胚细胞活检通常在授精的第5天或第6天进行，其主要优点是可从滋养层获得大量的细胞(20～30个)而不影响内细胞团，因此不会损害胚胎的进一步发育。但有研究证实，用囊胚细胞进行诊断，胚细胞的核型和胎盘细胞的核型可能不一致，存在着嵌合体现象，可导致误诊。这种取材方法的主要限制在于仅有很少的受精卵能发育到囊胚期(blastocyst stage)。近年来，细胞培养技术的不断改善使胚细胞取材成功率逐渐提高，但是仍不能满足诊断的需要^［8，9］。

二、染色体分析

自从90年代初，用FISH技术行植入前胎儿性别诊断以来^［2］，取生殖细胞或胚组织植入前诊断染色体病的技术得到快速发展，已有100多例完成诊断的胎儿顺利分娩^［1］。

1.FISH技术：FISH技术指将标记的探针和待测序列杂交，根据杂交信号的有无及类型，达到诊断染色体病的目的。用于杂交的探针包括3类：(1)染色体计数探针：主要指来自染色体着丝粒部位的特殊序列，如α卫星DNA或染色体的特异片段、Y染色体长臂的异染质区。(2)染色体单一序列的探针：指针对某一染色体上单一DNA序列的探针，例如诊断Y染色体性别决定区(sex determination region of Y chro- mosome, SRY)基因的探针，可用来诊断染色体有无缺失、重复，或诊断染色体微缺失综合征。(3)全染色体涂抹探针：这类探针特异地覆盖特定的靶染色体，可用来诊断染色体的结构异常，如缺失、插入、易位等。可根据临床需要，选用不同的特异探针进行特异诊断。依检测方法的差别，可将FISH分为：直接法及间接法。直接法用荧光素直接标记特殊的探针，经变性、杂交、漂洗后，可直接在荧光显微镜下检测染色体结构。间接法则在杂交、漂洗之后，依抗原、抗体反应的原理，既将荧光素与探针结合，又将荧光素与其特异的抗体结合，将待测信号放大，从而使特异的靶序列得以检测。直接法具有直接、特异性高、快速的特点，在PGD领域得到了广泛的应用。间接法放大作用强，对单一序列诊断的敏感性较高。

用FISH行PGD，鉴别胚细胞有无染色体畸变的研究进展很快，从单色FISH发展到双色FISH乃至多色FISH(mult- iple FISH, M-FISH)，已经可以用不同的荧光素以不同比例混合得到多种颜色的探针，诊断人类的多条染色体有无异常^{［10，11］}。为了克服单一细胞诊断的局限性，增加单一卵裂细胞可以检测的染色体数目，有学者用重复FISH的方法，分析单一的卵裂细胞。Liu等用1个细胞重复做3次FISH，每次用不同的染色体探针，最多每个细胞可分析6条以上染色体^［12］。

2.CGH技术：CGH是在FISH技术基础上发展起来的新的染色体病诊断技术，以往多用于分析肿瘤的染色体畸变。这种杂交技术，以不同荧光素分别标记正常的参照系DNA和待测的DNA，然后以一定的比例将两种DNA混合杂交后用荧光显微镜检测。如果待测DNA发生突变，如缺失、重复、易位，荧光信号的强度及特征会发生改变，由此得以诊断。Well等1999年首先将该技术应用于PGD，他们用全基因组扩增(whole genome amplification, WGA)方法，将单一的胚细胞DNA用简并寡合苷酸引物PCR(degenerate oligonucleotide primed PCR, DOP-PCR)或引物延伸预扩增(Primer extension preamplification, PEP)方法得到单细胞的整个基因组序列后，用CGH分析单个的羊水细胞或胚细胞，可靠地诊断出13、14、18或21三体，也成功地诊断了性别。在DOP-PCR过程中，可将荧光标记的核苷酸直接掺入到扩增的序列中，能够清楚地检出细小的染色体异常，整个杂交可在24 h内完成，而PGD通常要求在48 h完成即可。这种方法能可靠地检出13、14、18三体并对性别进行鉴定，而对21三体的诊断却不稳定^［9］。

3.早熟染色体凝集(premature chromosome condensation, PCC)技术：PCC技术是80年代发展起来的一种细胞遗传学技术，在发育生物学及精子染色体研究领域有广泛应用。Verlinsky最先报道，用PCC技术结合全染色体涂抹技术，分析第二极体的核型^［4］。用IVF或ICSI方法获得正常的受精卵，从中取出第二极体，然后用细胞质注射的方法将第二极体注入到去核的卵细胞中，再用电刺激方式使卵细胞激活，将第二极体移入到单倍体的原核中，早熟凝集的染色体固定之后，进行全染色体涂抹，用免疫细胞化学的方法染色分析单倍体的核型，间接诊断卵子的染色体组成有无异常。38例中的25例可行染色体核型分析，其中包括有平衡易位的第二极体。母亲是易位携带者时，分析第一极体或第二极体可以了解母亲卵细胞原核的染色体有无异常。用第一极体分析染色体，要求在极体取出之后立即固定，以免染色体解聚。用第二极体分析核型则不受此限制，第二极体带有部分胞浆，因而具有染色体去凝集的能力，其染色体可进入间期形成一个核，甚至可以进行DNA复制^［13］。

三、PGD的进展

自1990年用PCR扩增Y染色体特异序列，选择性去除男性胚胎，预防性连锁遗传病以来，PGD取得了长足的进步。但是，PCR扩增失败导致性别误诊使得人们转用FISH技术行性别分析^［14］。同时检测X和Y染色体，不仅能够诊断胎儿的性别，也能同步分析性染色体有无异常。45，X和47，XXY是女性及男性最常见的染色体畸变之一。因为嵌合体的存在，单纯进行PCR扩增Y染色体片段可能致假阴性，例如45，X/46，XY个体，若取到的卵裂细胞为45，X，则SRY基因阴性，但检查个体实际上仍有可能患X性连锁遗传病。临床PGD经验证实，双色FISH分析有两条X的个体，在出生后从未发现有Y染色体嵌合的现象^［15］。目前，用FISH诊断胎儿性别排除X性连锁遗传病已被绝大多数PGD实验室列为PGD鉴别胎儿性别的首选方法^［1，2］。

诊断染色体结构畸变，如缺失、倒位、易位、重复等，至少应获得一个可供分析的中期分裂相，用PCC及WCP技术分析第二极体的染色体核型可以诊断母源性的平衡易位。而取单一待测的生殖细胞或卵裂细胞用全基因组扩增的方法获得各染色体上众多DNA序列，然后可用CGH诊断来自父亲一方或母亲一方的染色体畸变。因此，对染色体数目及结构异常造成的多种畸变，目前已有适宜的技术并且正运用于临床植入前诊断染色体病。

四、现存的问题

虽然已有行PGD的新生儿出生，染色体病植入前诊断的一些问题仍待解决。首先是获得足够的可供分析的胚胎细胞，特别是如何使尽可能多<