关键词： 抗药性，多药；卵巢肿瘤；顺铂

【摘要】目的以较大剂量和反复间歇用药的方式建立卵巢上皮性癌顺铂(cDDP)耐药细胞株3AO/cDDP，并检测其肺耐药蛋白（LRP）、多药耐药相关蛋白（MRP）和P-糖蛋白（P-gp）的表达。方法以卵巢上皮性癌化学治疗用药的最低剂量换算终浓度，采用大剂量cDDP（10 μg/ml）反复间歇24 h暴露法建立3AO/cDDP细胞株;用流式细胞仪（FCM）检测LRP、MRP和P-gp的表达。结果历时4.5个月建成3AO/cDDP细胞株，耐药性稳定，耐药指数为1.62，与临床耐药指数相近。FCM检测MRP、 P-gp的表达，3AO/cDDP与3AO相比，差异无显著性（P＞0.05), LRP的表达明显升高（P＜0.01)。结论3AO/cDDP 是以不同的诱导方式建立起来的对cDDP耐药的卵巢上皮性癌细胞株模型；3AO/cDDP的cDDP耐药与LRP表达升高有关，而与MRP、P-gp表达无关。

Establishment of Cisplatin-induced Multidrug Resistant Human Epithelial Ovarian Cancer Cell Line 3AO/cDDP and Its Expressions of Multidrug Resistance Proteins

CHEN Jianli, YANG Ruifang, LIU Fusheng, et al

(^*Department of Obstetrics， Hospital of Obstetrics and Gynecology, Shanghai Medical University, Shanghai 200011, China)

【Abstract】ObjectiveTo establish multidrug resistant ovarian cancer cell line 3AO/cDDP by exposing parent cell line intervally and repeatedly to high-level concentration of cisplatin,and to detect expressions of lung resistance protein (LRP),multidrug resistance-associated proterin(MRP) and P-glycoprotein (P-gp). MethodsUsing the corresponding dose calculated from clinical chemotherapy,we established 3AO/cDDP,with 3AO exposed intervally and repeatedly to high-level concentration of cisplatin at 10 μg/ml for 24 hours each time; LRP、MRP and P-gp expressions were detected with flow cytometry(FCM). Results 3AO/cDDP was established after 4.5 months with stable resistance and the drug resistant index was 1.62 which was similar to clinical resistance degree. Low expression levels of MRP and P-gp were found in both 3AO and 3AO/cDDP, and no statistical difference between the two lines（P＞0.05).However, LRP expression level in 3AO/cDDP was significantly higher than that in 3AO with FCM detection（P＜0.01). Conclusions3AO/cDDP,induced by exposing 3AO to high-level concentration of cisplatin intervally and repeatedly, is an ideal model for investigation of cisplatin resistance.Cisplatin resistance in 3AO/cDDP could be related to high LRP expression and be not associated with MRP or P-gp.

【Key words】Drug resistance,multiple; Ovarian neoplasms; Cisplatin

耐药是严重制约卵巢上皮性癌患者化学治疗（化疗）疗效的重要因素^［1］。目前，国内外对卵巢上皮性癌化疗耐药机理的认识主要来自体外实验的研究成果，多采用逐渐增加培养基中药物浓度的方法建立耐药细胞株来进行研究，但这些研究存在两个问题，一是诱导耐药所用的化疗药物并非卵巢上皮性癌患者化疗的首选药物^［2］；二是逐渐增加培养基中药物浓度的方法与临床化疗反复间歇用药的特点相差甚远^［3］。研究发现，同一种肿瘤细胞，用同一种药物诱导，诱导药物终浓度相同，不同的诱导方法可得到耐药机理不同的耐药细胞株^［4］。因此，本研究采用临床化疗首选药物的对应剂量和反复间歇给药的方式建立顺铂(cDDP)耐药细胞株，并初步检测了一些耐药相关蛋白在耐药细胞株中的表达。

材料与方法

一、材料来源

1. 实验药物：cDDP和卡铂(CBP)为山东齐鲁制药厂产品；紫杉醇(TAX)和鬼臼噻吩甙（VM26)为美国Bristol-Myers Squibb 公司产品；环磷酰胺(CTX)为上海华联制药有限公司产品；氟尿嘧啶(5-FU)为天津市氨基酸公司人民制药厂产品；甲氨蝶呤(MTX)为北京医科大学实验药厂产品；长春新碱(VCR)为广州明星制药厂产品；阿霉素(ADM)为浙江海门制药厂产品；鬼臼乙叉甙(VP16)为中外合资益侨（湖南）制药有限公司产品。

2.单克隆抗体（单抗）：鼠抗人P-糖蛋白(P-gp)单抗（JSB-1）购于武汉博士德生物公司；多药耐药相关蛋白(MRP)单抗（QCR-1）：由加拿大Queen Univ- ersity Cole 教授惠赠；肺耐药蛋白(LRP)单抗（LRP-56）：由荷兰Free University Scheper教授惠赠。

3.细胞株：人卵巢上皮性粘液性囊腺癌细胞株3AO购于中国科学院上海细胞生物研究所。细胞生长于含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于37℃、5%二氧化碳的培养箱中传代培养。

二、cDDP耐药细胞株3AO/cDDP的建立

1.3AO/cDDP细胞株的诱导：为使培养体系中cDDP终浓度与体内有效血浆浓度相接近，按如下公式^［5］换算：培养体系中cDDP终浓度为［（60×D）/（5 000）］×2×10³。其中60为平均成人体重（kg），D为临床用药剂量（mg*kg^-1*d^-1）,5 000为平均成人血容量（ml），2为除以血细胞比积50%，10³将mg换算成μg。以临床卵巢上皮性癌患者每个化疗周期cDDP用量的低线（30 mg）求得终浓度约为10 μg/ml。于对数生长期3AO细胞的培养液中加入cDDP至终浓度为10 μg/ml，作用24 h，弃去培养液，用磷酸缓冲液（0.01 mol/L,pH 7.4）洗3遍，换新鲜培养液，待细胞恢复生长，反复作用6次，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)快速比色法测半数抑制浓度(IC₅₀)逐渐稳定，撤药培养1个月，复测IC₅₀不变，表明耐药性稳定。细胞在浓度为0.5 μg/ml的 cDDP培养液中维持培养，用10%的二甲基亚砜培养液冻存复苏后测IC₅₀不变，所有耐药性实验均在无药培养两周后进行。

2.3AO及3AO/cDDP细胞株的生物学特性测定：（1）对数生长期细胞群体倍增时间测定：采用细胞计数法^［6］，重复3遍取平均值。（2）细胞周期分布及DNA、RNA含量分析：3AO及3AO/cDDP单细胞悬液各12份，采用流式细胞仪(FCM)检测。（3）染色体制备及分析：秋水仙素法^［6］。（4）克隆形成率实验：该实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一。方法参见文献［6］，克隆形成率为（克隆数/接种细胞数）×100%。（5）肿瘤标志物CA₁₂₅、CA_19.9、癌胚抗原（CEA）分析：在同等培养条件下取培养上清液以酶联免疫吸附（ELISA）法测定。（6）耐药谱分析：MTT比色法，以3AO/cDDP细胞株的IC₅₀和3AO细胞株的IC₅₀的比值表示耐药指数（resistance factor,RF）。

三、3AO及3AO/cDDP细胞LRP、MRP和P-gp表达的检测

采用FCM法，上机前以标准化荧光微球调整仪器，使其变异系数稳定在2%以内，每次检测10 000个细胞，共检测12组细胞，用Cell Quest Plot软件分析数据。

四、统计学方法

采用t检验和χ²检验。

结果

一、3AO/cDDP耐药细胞株的建立

1.3AO/cDDP的诱导：本研究采用大剂量（10 μg/ml）cDDP 24 h反复间歇暴露法，历时4.5个月建成耐药细胞株3AO/cDDP，测得3AO/cDDP的IC₅₀为226.41±0.02， 3AO的IC₅₀为139.53±0.01，RF为1.62（P＜0.01），建株后维持培养9个月，耐药性稳定。用浓度为10 μg/ml 的cDDP 作用24 h，反复作用6次，从撤药至下次克隆形成间隔时间分别为25、23、16、11、4、3 d，呈逐渐缩短的趋势。

2.3AO/cDDP生物学特性：（1）倍增时间：3AO/cDDP倍增时间为（23.76±0.28）h，3AO倍增时间为（24.96±0.09）h（P＞0.05）。（2）细胞周期分布及DNA、RNA相对含量分析：见表1。3AO/cDDP及3AO细胞周期分布差异显著, 3AO/cDDP细胞G₀+G₁期比例减少(P＜0.01), G₂+M期及S期比例增加（P＜0.01，0.05）。 3AO/cDDP细胞中DNA、RNA含量变化与S期、G₂+M期的细胞周期分布一致。（3）染色体分析：3AO/cDDP及3AO细胞各计数100个典型核型。每个核型中A～G各组染色体增减紊乱，无一定规律。3AO细胞染色体众数分布集中于36～40 条，以亚二倍体居多。每个核型中类似D组的中着丝粒或近中着丝粒巨大染色体数目比正常细胞增多，多为6～9条，且每个核型中均有至少1～2条类似D组的近端着丝粒巨大标记染色体。3AO/cDDP细胞染色体众数分布集中于40～42条，也以亚二倍体居多。与3AO相比，类似D组的近端着丝粒染色体数目增多，为6～12条。另外，两种细胞核型中均可见假二倍体、超二倍体、亚三倍体、假三倍体及超三倍体以及三射体、环状染色体、双着丝粒染色体、染色体断裂、双微小体等异常现象，但和3AO相比，3AO/cDDP细胞中较为少见。（4）克隆形成率实验：分别接种100、200个3AO及3AO/cDDP细胞，计数3AO克隆形成率分别为20%、55%；3AO/cDDP克隆形成率分别为27%、62%。两种细胞克隆形成率比较，差异无显著性（P＞0.05）。（5）肿瘤标志物CA₁₂₅、CA_19.9、CEA分析：经用ELISA法